对于细胞修复调理，小鼠在第0天接受照射(4.5Gy或9.5Gy)或化疗(35mg/kg)，并在第2天进行成像。对于HSPC移植，用CellTracker Green染色约105个FACS分选的HSPC(lin-/c-kit+/Sca1+)，并在第1天静脉注射。

在进行全骨髓移植时，四个月大的雄性C57BL/6J小鼠或雄性肌动蛋白-DsRed基因敲入小鼠在接受来自供体肌动蛋白-GFP基因敲入小鼠的25×106全骨髓细胞救治前4小时接受来自Cs137源的单剂量9.5Gy伽马辐照。

在照射和移植后的第五天，对肌动蛋白-DsRed受体小鼠进行成像，并测量骨髓中的pO2。C57BL/6J小鼠被处死，提取股骨和胫骨，准备骨髓用于分析循环细胞。使用红细胞裂解缓冲液在冰上裂解红细胞。按照制造商的建议，对剩余的骨髓细胞部分进行计数、固定、透化并用PE结合的Ki-67染色。循环细胞的分析在SORPFACSAria II仪器上进行。

为了绘制血管图，我们从供体C57BL/6小鼠身上抽取血液，分离RBC，用15μM的CFDA-SE在37℃下标记7×106 RBC 12分钟(标记浓度约为20×106 RBC/毫升，在不含Ca+0.2%牛血清白蛋白+0.2g/L葡萄糖的PBS中)，然后洗涤2次。然后，我们将RBC悬浮于200μL400nMQtracker 655血管标记-PBS溶液或200μL 3mg/ml 70kDa RhodamineB-Dextran血管标记-PBS溶液中，并在成像前立即静脉注射到供体Nes-GFP小鼠体内。

在体内抗Sca-1染色方面，我们首先证明了抗Sca-1抗体的体内特异性。我们给一只C57BL/6J小鼠静脉注射了20微克的Trustainfcx(BioLegend目录#B164564)以阻断非特异性Fc结合。两小时后，我们静脉注射了约15μg PE-Cy7抗Sca-1抗体(BDBiosciences目录#108114)和约15μg PerCP-Cy5.5大鼠IgG2a同型对照抗体(eBioscience目录#45-4321-80)。然后，我们在24小时后对BM进行成像，发现与同型对照相比，抗Sca-1抗体具有很高的特异性(数据未显示)。然后，我们在Nes-GFP小鼠中重复了相同的实验。

图像量化

使用轴向叠层，按照之前的方法计算出每个pO2测量值到最近的骨表面(骨膜)的距离。简言之，利用勾股定理确定三维空间中到骨膜的最短距离。使用罗丹明B右旋糖酐信号测量血管直径。该测量仅在x-y平面上进行，是血管腔的直径。距离和血管直径的测量均在ImageJ v.1.47p中进行。为便于显示，调整了图1a-b、1e、4a-b、扩展数据图4、6和7以及扩展数据视频1的亮度和对比度。所有图像分析均在原始图像上进行。在图1a中，显示的最大强度投影图像仅包括蓝色通道中约23μm的深度。我们没有包括蓝色通道的整个厚度，因为在最浅的深度，骨SHG信号覆盖了图像的大部分。

为了测量血管的距离，使用Fiji(ImageJA v.1.45b)将三维堆叠图像重新切成垂直平面(Y-Z、X-Z)，并进行数字旋转以消除头骨相对于成像平面的倾斜。随后，测量每个R/G/B通道沿Z方向的灰度强度曲线，并将其拟合为经验指数衰减曲线，然后将其倒数乘以每个堆栈图像，以均衡图像强度与深度的函数关系。然后，将三维叠加图像转换成二值图像，并手动验证结构的准确性。在二值化的红色(血管)通道堆栈图像上应用精确欧氏距离变换(EEDT)函数，以32位灰度图像堆栈的形式返回每个非血管像素到最近血管壁的三维距离。使用二值化蓝色(骨骼)通道堆栈排除了骨髓空间以外的像素。因此，EEDT距离直方图描述了骨髓内非血管空间中每个像素到最近血管的距离分布。

信噪比和统计分析

pO2测量值的信噪比(SNR)用以下公式计算：

其中，n是光子计数的数量，nBD是使用上述背景值确定的背景计数。nBD是暗计数和杂散光背景信号的总和，其中大部分来自暗计数。本研究不包括信噪比低于20的磷光测量。

实验所需的样本量是根据初步数据结果估算的。除图1f和图4c分别采用双尾、配对学生T检验和单尾、配对学生T检验外，所有p值均采用双尾、不等方差学生T检验。对同一数据集进行多次统计检验时，统计显著性采用Bonferroni校正。所有实验均未进行盲法或随机化。

图1 BM血管密度和含氧量。

(a)小鼠腓肠肌的可见光内最大强度图像(约75μm厚)，显示血管(红色，Qtracker655血管染料)和骨(蓝色，胶原SHG)。(b)三维虚拟成像堆栈的相应单个平面，显示血管(红色)、骨SHG(蓝色)以及BM中每个血管外像素到最近血管壁的三维欧氏距离测量值(EDM，绿色)。(c)全三维成像堆栈中所有EDM的直方图。(d)与骨膜和皮质骨血管中的pO2相比，骨髓中的pO2明显较低。每个点代表一个单独血管或间隙位置的pO2测量值(8只小鼠的骨膜、皮质骨、BM血管内和BM血管外的血管/位置分别为8、21、55和40个)。图中显示了每组数据的平均值(黑线)和±标准偏差(阴影框)。(e)血管从骨骼进入BM的最大强度投影图像。骨骼(蓝色)和血管(黄色)分别用SHG和RhodamineB-dextran/PtPC343荧光勾勒。两个箭头分别指向血管进入BM前后测量pO2的位置。(f)追踪进入BM的单个血管时pO2的下降(n=4只小鼠的8根血管)。显示的是每组数据的平均值(黑线)。刻度线~100μm。

图2根据血管直径和距骨膜内表面的距离，血压pO2有所变化。

(a)血管平均直径(绿线，4只小鼠的38根血管)、血管内(红线，4只小鼠的38根血管)和血管外(蓝线，3只小鼠的39个位置)pO2与骨表面到测量位置的距离呈函数关系。误差为±标准偏差。(b)nestin+血管(红色圆圈，n=9根血管，来自3只小鼠)和nestin-血管(蓝色正方形，n=12根血管，来自3只小鼠)的直径与骨内膜表面距离的函数关系图。(c)同样的nestin+血管和nestin-血管的pO2与血管直径的函数关系图。(d)nestin+(红色圆圈，n=17根血管，来自7只小鼠)和nestin-(蓝色方框，n=16根血管，来自5只小鼠)血管的pO2。显示每组数据的平均值(黑线)和±标准偏差(阴影框)。

图3细胞修复治疗后和HSPC归巢部位的BMpO2。

(a)亚致死(4.5Gy，n=5只小鼠的13个血管和29个血管外位置)或致死(9.5Gy，n=2只小鼠的40个位置)伽马辐照两天后，或丁胺(35mg/kg，n=6只小鼠的40个位置)调理两天后的BM pO2。图1d中未经处理的对照组pO2与之比较。(b)血管外pO2测量值与4.5Gy照射2天后测量位置到骨表面距离的函数关系图(n=44个位置，来自4只小鼠)。(c)HSPC归巢部位的pO2与丁胺苯磺吡啶治疗受体的整体BM pO2的比较(n=17个HSPC，来自6只小鼠)。未观察到有统计学意义的差异。在(a)和(c)中，显示了每组数据的平均值(黑线)和±标准偏差(阴影框)。

图4细胞修复调理后的活细胞膜血管图谱和细胞性对局部pO2的影响。

(a)nestin-GFP小鼠的血管连接图显示，nestin+血管位于窦道的上游并向窦道排水。表示血流方向的箭头是通过视频速率成像跟踪标记的RBC的移动确定的，并叠加在BM血管的最大强度投影图上(红色=血管染料，绿色=nestinGFP/RBC，蓝色=SHG骨信号)。绿色实线表示血管与邻近的nestin+细胞，白色虚线表示nestin-血管。缩放条~100μm。(b)一个通用DsRed受体的骨髓在移植了来自通用GFP供体的2，500万个骨髓细胞5天后的体内图像。红色=DsRed，绿色=GFP，蓝色=骨的SHG。缩放条~100μm。(c)移植后第2天(n=3只小鼠)和第5天(n=2只小鼠)，通过FACS对绿色(供体)和红色(宿主)骨髓细胞进行Ki-67染色。每个符号代表不同的小鼠。刻度线(第2天)为平均值的±标准偏差。(d)与小的供体细胞群/单细胞(4只小鼠，n=16个位置)和宿主细胞群/单细胞(5只小鼠，n=40个位置)相比，大的供体细胞群(4只小鼠，n=19个位置)区域的体内pO2值。图中显示了每组数据的平均值(黑线)和±标准偏差(阴影框)。