我们在硫胺素治疗24小时后进行了HSPC移植(每个受者约105个系-cKit+Sca1+(LKS)细胞)，并在18-24小时后测量了每个进入钙基底膜的LKS细胞周围的pO2。我们得到的pO2值几乎涵盖了化疗后(升高的)BM pO2的整个范围(图3c)，这表明HSPC并没有寻找由低pO2定义的特定壁龛作为优先归巢的位置。

这些观察结果促使我们重新研究血液流动在BM中的情况。具体来说，我们想知道，在nestin+与nestin-血管中观察到的pO2差异，以及在稳定状态与放疗/化疗动物中观察到的pO2差异，是否至少可以部分地通过血流曲线来解释。我们注射了CFSE标记的红细胞(RBC)，并将成像速度提高到每秒120帧(扫描1/4帧)，以便跟踪单个RBC的流动方向和速度。有趣的是，在nestin+血管中观察到的红细胞流速最高(>2毫米/秒，而在正弦血管中为0.2-1毫米/秒)。血管网络图显示，nestin+血管总是位于窦状血管的上游，并向窦状血管排水(图4a)，这表明nestin+血管具有动脉特征。荧光抗Sca-1抗体的体内免疫染色证实它们是动脉(扩展数据图7a)。

使用标记的红细胞进行血流成像还有助于克服放疗/化疗后染料泄漏的问题，并使我们能够通过分析视频序列中流动红细胞的轨迹来划分功能性血管。我们发现，在致命性照射后2-6天(扩展资料图7b和扩展资料视频1)，红细胞的流动出奇地旺盛，而此时红细胞的细胞活力正急剧下降(扩展资料图8)。充足的血液供应和减少的氧消耗(减少的骨髓细胞活力)可以解释放疗和化疗后pO2升高的原因。细胞减少也可以解释为什么骨髓抑制调理后血管内和血管外pO2梯度消失。

为了进一步确定细胞活力与耗氧量之间的联系，我们将来自GFP供体小鼠的25×106个总骨髓细胞输注到接受致死性照射的DsRed受体中(图4b)。我们在第2天和第5天通过FACS验证了大部分增殖(Ki-67+)细胞都在供体部分(图4c)。然后，通过体内成像，我们发现骨髓中包含供体(GFP+)和受体(DsRed+)细胞的异质斑块，局部pO2存在相应差异(图4b)。较低的pO2与大群绿色细胞有关，这与增殖细胞更热衷于消耗氧气的观点一致(图4d)。

总之，直接测量血液中的绝对pO2揭示了一个独特的缺氧景观，即血管密集(供氧)和细胞密集(耗氧)。供氧和耗氧之间的平衡会因放疗和化疗等压力而改变。局部地形是由基础细胞内不同类型血管的定位进一步确定的(扩展数据图9)。特别是，靠近nestin+动脉的造血干细胞和靠近窦状血管的造血干细胞将经历不同的代谢环境，这凸显了进一步研究不同血管龛在造血干细胞调控中的作用的必要性。

方法

双光子pO2显微镜

显微镜由两个激发臂组成：一个视频速率激光扫描双光子成像臂和一个点检测双光子磷光寿命传感臂(扩展资料图1)。调谐到840或913nm的80MHz飞秒激光源的输出通过偏振分束器(PBS1)分为s偏振和p偏振。s偏振光束穿过PBS1进入成像臂，而p偏振光束则偏转90°进入点检测臂。每个臂的功率可通过旋转PBS1前面的半波板进行调节。这些偏振光束随后在进入物镜前由第二个偏振分光镜(PBS2)重新组合。

在点检测臂上，光束利用振镜扫描仪(6220H)扫过狭缝孔径(NT38-560)，然后成像到样品上，形成一条~3.5μm的扫描线。这种一维扫描同时达到两个目的。首先，它产生了一个脉冲持续时间可调(15-40微秒)的激发门，由狭缝孔径上的扫描速度决定。其次，它可以减少可能伴随静态激发的三重态饱和效应，从而有助于防止轴向点扩散函数的退化。使用激发门后，使用定制的光子计数电路记录单个磷光光子的到达时间。然后分析光子到达时间的直方图，以获得三重态的寿命。我们发现pO2测量的标准偏差通常低于4mmHg，并且与信噪比(SNR，数据未显示)成反比。

对于成像臂，我们使用了与之前描述的类似的扫描引擎，并使用PBS2将光束与点检测臂结合在一起。然后，光束由工作距离为280μm的60×1.2 NA水浸式无穷远校正近红外镀膜物镜聚焦。

PtP-C343的描述和校准

PtP-C343中的双光子天线香豆素343(扩展数据图3)在840纳米波长处的双光子吸收截面(σ2)约为28GM，荧光量子产率φfl)约为0.90。这意味着PtPC343的双光子作用截面(η=σ2φfl)约为25.2GM。C343和PtP的FRET效率(ϕFRET)约为0.68。在无氧条件下，PtP-C343的磷光寿命(τ0)约为60μs，其动态范围非常适合pO2的生理范围。为了进行校准，我们在体外38℃、pH值为7.4的PtP-C343缓冲溶液中记录了由氧电极(OX-500，UnisenseA/S，扩展数据图2)独立记录的pO2范围内的寿命测量值。我们的结果与已公布的同一批染料的曲线相吻合(扩展数据图2)。

动物制备

所有程序均已获得麻省总医院机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。所有体内PtPC343实验均使用年龄小于6个月的雄性野生型C57BL/6J(杰克逊实验室)和C57BL/6 Nes-GFP小鼠。在典型实验中，通过吸入1.35%-2%异氟醚和氧气的混合物缓慢诱导小鼠麻醉。为维持麻醉状态，将混合气体降至1.25%异氟醚和98.75%氧气。该方案最大程度地减少了麻醉对组织pO2的影响。通过头皮上的U形切口暴露髑髅骨，以创建皮瓣，并在头皮上放置2%的甲基纤维素凝胶以进行折射率匹配。

然后，给小鼠静脉注射100-180μl悬浮于0.9%磷酸盐缓冲盐水中的1.7mM PtP-C343，以及40-60μl 10mg/ml 70kDa RhodamineB-Dextran。我们使用了相对较多的PtP-C343，以便在血管外达到足够的浓度，进行间质pO2测量。如前所述，将小鼠置于加热平台上，头骨置于物镜下方。每次成像时扫描小鼠颅骨约4×6mm的区域，包括左右额骨内大部分矢状旁BM腔，并选择适当位置进行pO2测量。与之前的体内研究一致，使用PtP-C343探头没有观察到明显的毒性或光毒性。成像结束后，用6-0线缝合头皮，让小鼠苏醒。在最终实验中，小鼠会因脊髓脱落或二氧化碳安乐死而死亡。

在分析血管大小与骨内膜表面距离的函数关系时，我们注意到，距离骨表面20-40μm和>40μm的血管普遍比0-20μm区域大，平均直径分别为27.0μm和26.9μm(p分别<0.002和0.06，图2a)。距离骨表面大于40μm的区域构成了密集的正弦血管网络，与靠近骨表面的血管相比，其形状更不规则(图2a)。