摘要

了解微环境或生态位如何调节干细胞活性，是理解干细胞生物学和制定干细胞治疗策略的核心。低氧张力(缺氧)通常被认为是维持多种干细胞类型静止的共同生态位特征。然而，支持缺氧龛存在的证据主要来自间接证据，如蛋白质组分析、HIF-1和相关基因的表达，以及替代性缺氧标记物(如咪唑)染色。在这里，我们对活体小鼠骨髓(BM)中的局部氧张力(pO2)进行了直接的活体测量。利用双光子磷光寿命显微镜(2PLM)，我们确定尽管血管密度非常高，但骨髓的绝对pO2却相当低(<32mmHg)。我们进一步发现了局部pO2的异质性，在较深的窦周区域发现了最低的pO2(约9.9mmHg或1.3%)。相比之下，骨膜内区域的缺氧程度较低，因为该区域有小动脉灌注，而这些小动脉的标记物nestin通常呈阳性。这些pO2值在放疗和化疗后发生显著变化，表明压力在改变干细胞代谢微环境中的作用。

造血干细胞(HSC)龛位在BM内的确切位置仍然难以确定，有证据支持血管龛位和骨内膜龛位的存在。由于包括骨内膜区域在内的基底膜灌注密集，我们不禁要问，如此高血管化的组织如何能在低氧微环境中孕育造血干细胞？我们通过仿真模型发现，在远离血管的短距离内，可能存在非常陡峭的pO2梯度，从而形成缺氧区。然而，目前还没有关于直接测量BM内局部氧分布的报道。

扩展数据图2、PtP-C343溶液的PO2值与我们的显微镜记录的磷光寿命测量值的函数关系图。PO2由插入溶液中的氧气微电极测定。实线是不同实验室记录的同一批PtP-C343的已公布校准曲线。

在这里，我们在专为活体动物成像设计的双光子显微镜上实现了2PLM技术。这种全光学设计(扩展数据图1)可通过完整的头骨以微米级的空间分辨率在BM内的精确位置进行非接触式pO2测量。成像前，系统注入基于金属卟啉的双光子增强磷光探针PtP-C343。铂卟啉(PtP)的发射三重态对局部氧气浓度高度敏感。与溶解氧的双分子碰撞会缩短探针的三重态寿命并淬灭磷光。因此，通过测量激发脉冲后的磷光衰减时间τ，就可以根据预先建立的τvs.pO2校准曲线(扩展数据图2)确定pO2的绝对值。PtP-C343中的金属卟啉由树枝状聚合物和聚乙二醇(PEG)包覆层保护(扩展资料图3)，以确保生物相容性并防止探针与生物大分子发生不必要的相互作用。为了提高双光子激发截面，在树枝状聚合物外壳上接枝了几个香豆素-343(C343)分子，作为双光子"天线"，通过分子内能量转移将捕获的能量导向金属卟啉。

探针中香豆素单位的残余荧光使我们能够通过传统的双光子激发荧光观察到BM血管，同时通过胶原二次谐波发生(SHG)信号观察到骨骼。我们证实，BM中的血管密度很高(图1a-c)，图像堆栈中95%以上的体素距离最近的血管小于25μm(图1b-c)。然后，我们使用2PLM对血管内多个位置的BM pO2进行了量化，得到的数值范围为11.7到31.7mmHg(1.5-4.2%)，平均值为20.4mmHg(2.7%)。这些值明显低于大脑微血管、骨膜和皮质骨中的pO2值(图1d)。在许多情况下，我们能够跟踪单个血管从骨骼穿入BM腔的过程(图1e)。当沿着单个血管追踪时，我们发现在进入BM腔前后测量到的pO2急剧下降(图1e-f)。血液从低细胞度区域(皮质骨)流向高细胞度区域(BM)，沿血流方向氧气迅速耗尽，这让人联想到血管进入代谢需求高的实体瘤时观察到的纵向pO2梯度。

由于BM血管的通透性相对较高，注入的探针(直径约3-4纳米)扩散出血管，并在几分钟内积累到足够的浓度(扩展数据图4)，从而可以测量间质空间的pO2。根据数学模型，我们发现远离血管的侧向pO2梯度很陡，平均血管外pO2为13.3mmHg(1.8%)，范围在4.8到21.1mmHg(0.6-2.8%)之间(图1d)。

我们在BM中测得的pO2值(血管内约20.4mmHg，血管外约13.3mmHg)与之前报道的使用氧电极测得的约18mmHg值非常吻合。不过，该测量方法缺乏空间分辨率，而且针电极的插入很可能损伤了微血管，因此只能记录到血管内和血管外pO2的平均读数。尽管如此，综合来看，这些结果支持这样一种观点，即尽管血管密度很高，但整个BM是一个缺氧组织。

为了更精细地观察BM内的氧分布，我们注意到血管是异质的，较小的血管更靠近骨膜内表面(图2a)。直径小于15μm的血管的2PLM显示的pO2(22.7mmHg，3.0%)高于直径大于15μm的血管(19.5mmHg，2.6%，p＜0.03)。因此，当我们分析距骨膜不同距离的pO2值时，发现距骨>40μm区域的pO2值最低，血管内为17.7mmHg，占2.4%；血管外为9.9mmHg，占1.3%(图2a)。在大多数较小血管所在的骨膜内区域(0-20μm区域)，pO2读数略高，血管内的数值为21.9mmHg(2.9%，p<0.03)，血管外的数值为13.5mmHg(1.8%，p<0.01)(图2a)。这些测量结果表明，随着与骨膜距离的增加，pO2梯度适中，但梯度的方向出乎意料。我们发现，pO2并非随着距离骨膜的增加而降低，而是随着距离骨膜的增加而向更缺氧的窦状区域移动，而不是骨膜内区域最缺氧。

由于目前还没有造血干细胞特异性标记物可用于观察平衡状态下的内源性干细胞，我们使用了nestin-GFP小鼠来帮助确定造血干细胞所在的位置。nestin由参与造血干细胞维持和运输的BM间充质干细胞(MSCs)亚群表达，血管周围的nestin-GFP亮细胞定义了静止造血干细胞龛位。我们推断，如果缺氧调节静止，那么nestin-GFP细胞就应该是BM缺氧区域的标志。在nestin-GFP小鼠中，我们证实nestin+细胞主要分布在血管周围，移植的造血干细胞也靠近nestin+血管(扩展数据图5)。nestin+血管与nestin-血管在解剖学上截然不同，它们更靠近骨表面(10.9μm vs. 25.5μm，p<0.02)，直径更小(9.5μm vs. 22.9μm，p<2×10-6)(图2b)。与我们的预期相反，我们发现nestin+血管的pO2明显高于nestin-血管(22.8mmHg vs. 17.6mmHg，p<0.0007)(图2c-d)。

接下来，我们研究了移植的造血干细胞/祖细胞(HSPCs)是否归巢于具有不同pO2水平的骨髓龛。移植前，受体动物接受放射或化疗(35mg/kg的丁胺卡那霉素)进行细胞再生调理。值得注意的是，这两种治疗方法都导致了整个骨髓细胞pO2的大幅升高(图3a)。考虑到放疗和化疗后血管都受到了严重破坏，pO2的升高令人震惊(扩展数据图6a-c)。此外，虽然亚致死照射(4.5Gy)后血管内pO2值基本不变，但血管内和血管外pO2之间的梯度消失了，血管外pO2上升到与血管内pO2相同的水平(图3a)。随着与骨膜距离的增加，pO2下降的"负"梯度也消失了(图3b)。在致命性照射和丁胺苯磺胺治疗的病例中，广泛的血管损伤导致染料大面积渗漏，以至于血管内和血管外空间的界限再也无法划分。