2.氢处理可抑制胶质瘤细胞的干性

图2：吸入氢气后，生物标志物的表达发生了变化。在大鼠C6胶质瘤和小鼠U87皮下模型中，吸入氢气都会降低CD133、Nestin、Ki67和CD34的表达。CTRL：对照组；HI：氢气吸入组

为了确定分子氢对胶质瘤细胞干性的潜在影响，研究人员在大鼠C6胶质瘤和小鼠U87皮下模型中检测了干性标记物的表达。免疫组化（IHC）染色显示，在大鼠C6或小鼠U87模型中，与对照组相比，氢气组CD133和Nestin的表达明显下降（图2）。与对照组相比，HI组Ki67和CD34的表达也明显下降（图2）。

图3：处理减弱了胶质瘤细胞的干性。氢处理后，用免疫荧光染色法评估胶质瘤细胞中GFAP和CD133的表达水平（a）。氢气处理后，CD133阳性细胞的数量用流式细胞仪测定（b）。胶质瘤细胞的癌干细胞自我更新能力是通过球形成试验确定的。拍摄的代表性图像(c)和量化(d)。GFAP，神经胶质纤维酸性蛋白；CTRL，对照组；HRM，富氢培养基。

为了证实分子氢对胶质瘤细胞干性的影响，在体外对C6和U87细胞进行了免疫荧光。富氢培养基使C6和U87细胞的CD133表达明显减少（C6，26.08±1.93vs.45.02±3.47，p=0.0088；U87，26.11±3.89vs.51.81±3.09，p=0.0066）。氢处理也增强了两种细胞系胶质标记物GFAP的表达（C6，64.35±5.69vs.22.87±2.23，p=0.0025；U87，62.45±3.20vs.12.51±1.29，p=0.0066）（图3a）。

为了进一步证实分子氢对胶质瘤细胞干性的抑制作用，研究人员使用流式细胞术测定了C6和U87细胞中CD133阳性细胞的比例。与对照组相比，氢处理明显降低了C6（15.39±0.70vs.24.83±1.30，p=0.0031）和U87（13.70±0.97vs.33.98±0.52，p<0.0001）细胞中CD133阳性细胞的比例（图3b）。为了研究分子氢对胶质瘤细胞癌干细胞自我更新能力的影响，我们进行了球形成试验。如图3c和d所示，氢处理显著抑制了胶质瘤细胞的球形成能力，表现为肿瘤球的数量减少（C6，3.00±1.15vs.11.33±1.20，p=0.0075；U87，1.67±0.33vs.15.00±1.53，p=0.001）和体积变小。

3.氢处理促进胶质瘤干样细胞（GSC）分化

图4氢处理诱导C6亚球分化。氢气处理后，用免疫荧光染色法评估C6亚球中GFAP和CD133的表达水平（a）。氢气处理后使用流式细胞仪测定CD133阳性细胞的数量（b）。GFAP：神经胶质纤维酸性蛋白；CTRL：对照组；HRM：富氢培养基

为了直接确定氢处理对GSCs的影响，进行了亚球形成试验和表面标记分析。C6细胞生长形成肿瘤球，原球解离4-5天后形成子球。免疫荧光结果显示，氢处理明显增加了GFAP的表达（58.13±6.63vs.18.60±1.79，p=0.0045），并显著下调了CD133的表达（13.43±2.46vs.32.34±6.14，p=0.046）（图4a）。流式细胞术分析表明，氢处理组CD133阳性细胞数量明显减少（图4b）。

4.氢处理可抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和集落形成能力

图5氢处理抑制了C6和U87细胞的迁移、侵袭和集落形成能力。氢气处理后使用伤口愈合试验检测细胞迁移能力（a）。氢气处理后，使用Matrigel侵袭试验测定细胞的侵袭能力（b）。迁移和侵袭试验的定量代表三个独立实验（c）。氢气处理后使用集落形成试验评估集落形成能力（d）。菌落形成检测的定量代表三个独立实验（e）。

为了确定分子氢对胶质瘤细胞迁移的潜在影响，我们采用了体外创伤试验。如图5a和c所示，氢处理明显降低了C6细胞（14.47±0.72vs.47.83±1.05，p<0.0001）和U87细胞（12.67±0.50vs.33.68±1.69，p<0.0001）的运动性。与此同时，还进行了Matrigel侵袭试验，以确定氢处理对胶质瘤细胞侵袭的影响。如图5b和c所示，分子氢显著抑制了C6的细胞侵袭性（24.83±1.30vs.33.98±0.52，p<0.0001）和U87细胞（24.83±1.30vs.33.98±0.52，p=0.0005）。

为了确定氢处理对胶质瘤细胞集落形成能力的影响，进行了集落形成试验。在C6和U87细胞中，与对照组相比，氢处理组的集落形成细胞数明显减少（C6，57.67±4.37vs.116.70±6.12，p=0.0014；U87，16.67±0.88vs.30.00±1.53，p=0.0016）（图5d、e）。

讨论：

分子氢对多种肿瘤的影响已有报道，包括皮肤鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、胸腺淋巴瘤、肝脏肿瘤、肾细胞癌和结肠癌。然而，分子氢是否对GBM有抗肿瘤作用仍是未知数。在本研究中，我们首次提供了氢气处理可对GBM细胞产生抗肿瘤作用的证据。利用大鼠正位胶质瘤模型和小鼠皮下异种移植模型，我们证明了吸入氢气可以有效抑制GBM肿瘤的生长，延长GBM小鼠的生存期。IHC检测进一步证实了这一点，氢气处理抑制了增殖标记物Ki67和血管生成标记物CD34的表达。IHC染色也显示，干性标记物的表达在吸入氢气后明显减少。体外细胞研究进一步证实了这一点。氢气处理可抑制胶质瘤细胞在体外的迁移、侵袭和集落形成。

GBM的预后很差，至少部分原因是无法成功通过血脑屏障（BBB）给药。由于氢气分子小且无极性，它可以轻松穿过血脑屏障。氢气的这一特性及其生物学益处使其成为治疗GBM的理想候选物质。值得注意的是，我们的体内研究使用了67%的氢气和33%的氧气。氢气和氧气的浓度远远高于之前大多数研究中使用的浓度（≈1-4%H2和21%O2）。虽然低浓度分子氢在多种疾病中的作用已被广泛报道，但也有一些研究使用了高浓度分子氢，同样具有抗肿瘤作用。综上所述，这些研究可能表明，高浓度分子氢对治疗癌症可能更有效，但分子氢的剂量-反应关系还需要进一步研究。

胶质瘤干样细胞（GSCs）是胶质瘤肿瘤细胞中罕见的亚群，具有无限增殖、自我更新和多能分化的能力。这些细胞负责胶质瘤的起始、侵袭性、耐药性和随后的复发，因此被认为是治疗GBM的重要靶点。在本研究中，我们首次证明氢气处理可诱导GSCs分化。体内和体外研究均表明，氢气处理可减轻胶质瘤细胞的干性，这表现在干性标志物（CD133和Nestin）的表达减少和胶质标志物GFAP的表达增强。氢处理还抑制了成球能力。为了直接评估氢处理对GSC分化的影响，我们检查了C6亚球细胞。结果表明，氢处理可升高GFAP的表达，下调CD133的表达。流式细胞术分析也显示，氢处理的C6亚球中CD133阳性细胞数量减少。

先前的一项研究表明，将干细胞暴露于血清可诱导线粒体活性氧（ROS）以及氧化应激反应，导致干细胞出现分化形态并下调干性标志物。在一些实验系统中，ROS也可诱导干细胞正常分化。因此，作为一种抗氧化剂，分子氢能诱导GSC分化似乎是自相矛盾的。以往的研究表明，分子氢可选择性地清除具有高度细胞毒性的羟自由基；然而，这种解释并不能充分解释分子氢的多种作用。例如，川崎等人报告说，虽然分子氢不能减少间充质干细胞（MSCs）中的羟自由基，但却能有效延长骨髓的体外复制寿命，而不会丧失分化潜能。耐人寻味的是，也有报道称分子氢可通过轻度诱导线粒体超氧化物的产生而起到丝裂激素的作用。也许氢诱导的ROS促进了GSCs的分化和干性下调。然而，确切的内在机制还需要进一步研究。

我们还研究了分子氢对GBM细胞迁移、侵袭和集落形成能力的影响。结果显示，氢处理抑制了C6和U87细胞的迁移、侵袭和集落形成能力。我们之前对卵巢癌细胞的研究也报道了类似的效果。GBM的一个特征是肿瘤细胞广泛侵入正常脑组织并沿血管径向扩散，导致无法完全切除所有恶性细胞。包括化疗和放疗在内的一线细胞毒疗法对阻止GBM的侵袭基本无效。因此，分子氢对胶质瘤细胞迁移和侵袭的抑制作用使其极有希望成为一种潜在的治疗GBM的候选药物，无论是单独使用还是与其他抗癌疗法联合使用。

结论：

本研究表明，吸入67%的氢气对GBM有抑制作用。体内和体外研究均表明，分子氢能诱导GSCs理想的分化。此外，分子氢还能抑制GBM细胞的迁移、侵袭和集落形成能力。因此，我们的研究结果表明，分子氢可能是一种治疗GBM的潜在抗肿瘤药物。有关其机制的进一步研究和临床调查非常有必要。