富氢培养基处理：

将金属镁棒放入DMEM/F12培养基（最终氢浓度为0.55-0.65Mm）中制成富氢培养基。使用针式氢电极（UnisenseA/S，丹麦奥胡斯）监测氢浓度。

核磁共振成像：

核磁共振成像研究使用布鲁克高场小动物核磁共振成像系统进行。在2Lmin-1氧气中用2%异氟烷麻醉荷瘤大鼠，并维持在正常体温。在肿瘤移植后的第17天和第26天，使用常规自旋回波序列采集每只大鼠的T2加权磁共振图像，参数如下：TR=3140ms，TE=37ms，带宽=130Hz，翻转角=180°，FOV=4cm×4cm，切片厚度=1mm。

组织学和免疫组化：

用石蜡包埋胶质瘤组织，然后切成8μm厚的切片。切片用3%过氧化氢处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶，然后用10%正常山羊血清孵育。去除阻断血清后，切片与一抗（包括抗-CD34、抗-Ki67、抗-CD133和抗-Nestin在4°C下孵育过夜。使用HRP结合的二抗进行检测，然后使用DAB试剂盒进行比色检测。所有数据均由双盲研究人员进行评估。

免疫荧光：

将细胞播种在盖玻片上，用4%多聚甲醛固定10分钟，用0.1%TritonX-100in PBS进行通透，并用1%BSA封闭1小时。细胞核用Hoechst染色，并用倒置显微镜获得荧光图像。

流式细胞术：

用流式细胞术分析培养细胞中CD133的表达。简言之，在4℃下用10%马血清在PBS中孵育细胞10分钟，然后在4℃下用一抗CD133孵育30分钟。离心后，收集的细胞与FITC结合的二抗孵育20分钟。染色后，使用流式细胞仪对细胞进行流式细胞术分析。

球形成试验：

收集并洗涤细胞以去除血清，然后以2.0×103/mL的密度悬浮于无血清DMEM或MEM/EBSS培养基中。每孔计数500个细胞，并将其播种到超低附着力六孔板上进行球形成试验。细胞在正常无血清培养基或含B27补充剂、20纳克/毫升表皮生长因子（EGF）和20纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的富氢无血清培养基中培养。培养基每3天更换一次。细胞培养10天，计数直径大于50μm的小球。

细胞迁移试验：

采用伤口愈合试验检测细胞迁移能力。简单地说，将细胞以1.0×106个/孔的浓度接种到六孔培养板中，培养24小时后，用塑料吸管尖在每个培养板的细胞表面划一条线。用PBS冲洗剩余细胞三次，去除漂浮的细胞和碎片，然后在普通完全培养基或富氢培养基中培养48小时。分别在伤口愈合后和愈合后24小时的时间点拍摄伤口愈合过程的数字图像。伤口愈合试验分三个独立实验进行。

细胞侵袭试验：

细胞侵袭能力的测定采用BDmatrigel侵袭室，按照生产商的方案进行。简而言之，在带有聚碳酸酯过滤器（孔径为8μm）的上腔涂上50μL Matrigel（0.8μg/μL，37°C，2h）。将100μL无血清培养基中的1×105个细胞接种到上腔，然后在下腔加入650μL含氢或不含氢的普通完全培养基。然后用棉签将上表面的细胞完全清除。下表面的细胞在固定后用0.1%（w/v）结晶紫染色，并从每个插入物中随机抽取5个视野，在×100倍放大镜下计数。侵袭试验在三重独立实验中进行。

菌落形成检测：

每孔计数一千个细胞并将其播种在六孔板中。在含氢或不含氢的普通完全培养基中培养14天，然后用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.1%结晶紫染色。只有当菌落至少包括15个细胞时才进行计数。进行三重独立实验，所有可见菌落均以人工方式计算。

统计分析：

采用双尾学生t检验比较细胞培养和体内实验的各组数据，结果以均数±SEM表示。所有统计分析均使用GraphPadPrism6.01进行。P<0.05的值被认为具有显著性。

结果：

1.吸入氢气可抑制体内胶质瘤的生长

图1：氢气吸入还能抑制U87皮下小鼠模型的肿瘤生长（d)，肿瘤重量（e）和肿瘤体积（f）均有所下降。CTRL：对照组；HI：氢气吸入组

图1：氢气吸入可抑制体内胶质瘤细胞的生长。在大鼠C6脑胶质瘤模型中，通过磁共振成像评估胶质瘤的生长情况。拍摄了具有代表性的图像（a）并对其进行了量化（b）。氢气吸入可延长中位生存期（c）。氢气吸入也抑制了U87皮下小鼠模型中的肿瘤生长

分子氢对胶质瘤细胞肿瘤生长的影响首先在大鼠C6胶质瘤模型中进行了评估。磁共振成像结果显示，在植入C6细胞后的第17天，氢化组（54.76±6.07）与对照组（51.23±9.11）的肿瘤大小无明显差异。但在第26天，HI组的肿瘤体积比对照组明显缩小（223.3±33.83mm3vs.363.3±34.80mm3，p=0.045）（图1a、b）。此外，吸入氢气还能延长中位生存期（28.00天对31.00天，p=0.0012）（图1c）。

为了证实分子氢对胶质瘤生长的影响，我们使用了小鼠U87皮下模型。如图1d-f所示，与对照组相比，吸入氢气可显著减少肿瘤重量（0.34±0.11gvs.0.79±0.11g，p=0.0078）和体积（181.30±48.02mm3vs.504.20±61.71mm3，p=0.0003）。