摘要：

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤。分子氢被认为是包括癌症在内的多种疾病的预防和治疗气体。在我们的研究中，我们试图评估分子氢对GBM的潜在作用。使用大鼠正位胶质瘤模型和小鼠皮下异种移植模型进行体内研究。动物每天吸入氢气（67%）1小时，共两次。核磁共振成像研究用于确定肿瘤体积。通过免疫组织化学（IHC）、免疫荧光染色和流式细胞术分析来确定表面标记物的表达。进行球形成试验以评估癌症干细胞的自我更新能力。还进行了细胞迁移、侵袭和集落形成试验。体内研究表明，吸入氢气能有效抑制GBM肿瘤的生长，延长GBM小鼠的生存期。IHC和免疫荧光染色表明，氢气处理可明显下调干性（CD133、Nestin）、增殖（ki67）和血管生成（CD34）标志物的表达，同时还可上调分化标志物GFAP的表达。体外研究也得到了类似的结果。氢处理还抑制了胶质瘤细胞的成球能力。此外，氢处理还抑制了胶质瘤细胞的迁移、侵袭和集落形成能力。这些结果表明，分子氢可作为一种潜在的抗肿瘤药物，用于治疗脑胶质瘤。

引言：

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的原发性恶性脑肿瘤，其特点是增殖迅速、向正常脑组织扩散性侵袭、化疗抵抗力强。目前治疗GBM的标准方法是最大限度切除肿瘤，然后进行放疗，并同时辅助替莫唑胺。GBM的侵袭性是根治性治疗的主要障碍，因为它使手术完全切除成为不可能，并导致治疗后肿瘤复发。尽管多年来一直在研究GBM的潜在新疗法，但目前的治疗策略仍不足以控制病情，1年相对生存率为37.4%，5年生存率为4.9%。因此，开发治疗GBM的新方法尤为重要。

自Ohsawa等人报道吸入1-4%的氢气可明显缩小大鼠脑梗塞的大小以来，分子氢就被认为是一种预防和治疗性医用气体。目前，已有170多种不同的人类和动物疾病模型证明了氢的潜在益处。最近，分子氢对癌症的影响引起了人们的极大关注。1975年，Dole等人在《科学》杂志上首次报道了氢气对皮肤鳞状细胞癌的治疗作用。他们发现，在总压为8个大气压的条件下，用97.5%的氢气对小鼠进行为期2周的高压氧治疗，可明显诱导肿瘤消退。由于高压氢气治疗的特殊条件，随后关于氢气抗癌作用的研究一直停滞不前，直到2007年Ohsawa等人报道了低浓度氢气的生物效应。几年后，Saitoh等人报道了中性pH值的富氢电解水（NHE水）可在体外细胞模型中达到抑制肿瘤生长和肿瘤侵袭的效果。随后的体外研究表明，分子氢可抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成，并诱导癌细胞凋亡。一些体内研究表明，分子氢可以防止癌变，抑制癌症进展，减轻化疗或放疗的副作用，增强化疗药物的抗肿瘤作用。虽然分子氢已在癌症治疗领域显示出潜力，但其抗癌特性仅限于少数几种肿瘤类型，其潜在的分子机制仍有待确定。

在本研究中，我们探讨了分子氢对GBM的可能治疗作用。我们使用体内和体外实验模型来评估分子氢的潜在作用。我们还研究了氢气作用的机制。

材料与方法：

动物和肿瘤细胞系：

雄性Wistar大鼠（8周龄，体重170-180克）和雌性BALB/c裸鼠（8周龄，体重20-24克）。动物饲养在22°C-25°C、12小时光-暗周期的标准条件下，以正常饮食喂养。

大鼠C6脑胶质瘤细胞和人类U87细胞来自美国类型细胞收集中心。细胞在5%CO2和37°C的DMEM/F12培养基中常规培养，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素。

大鼠C6脑胶质瘤模型：

实验前大鼠禁食1天。然后腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg）进行麻醉，并固定在立体定向装置中。然后用手术剪在颅骨中线切开头皮皮肤。然后，在颅骨前囟门后1毫米、矢状缝外侧3毫米处开孔。将带有微型注射器的30号针头插入距颅骨表面7毫米的深度，立体注射10μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的C6胶质瘤细胞（1×106）。注射过程持续10分钟，然后将针头固定在原位5分钟，再逐渐抽出3分钟，以防止溶液倒流。植入神经胶质瘤细胞后，大鼠被随机分为两组，包括氢气吸入组（HI）和对照组（CTRL）。

小鼠U87皮下模型：

BALB/c裸鼠皮下注射1×106个存活的U87细胞。注射后，小鼠被随机分为两组，包括氢气吸入组（HI）和对照组（CTRL）。肿瘤体积每周测量一次，计算公式如下：体积=宽度2×长度×0.4。

吸入氢气：

将一个透明的密闭箱（20cm×18cm×15cm）连接到氢氧雾化器，该雾化器产生67%的H2和33%的O2（V/V）。在大鼠C6胶质瘤或小鼠U87皮下模型建立的第二天开始进行氢气处理，直至实验结束。将小鼠置于氢气箱中，每天吸入混合气体两次，每次1小时。在吸入过程中，小鼠保持清醒并自由活动。使用热痕量GC超气相色谱法监测封闭箱中的氢气浓度。