3.2.吸水链霉菌5008培养过程中的pH变化

在5008的正常情况下，发酵液pH逐渐上升。在发酵早期，pH上升缓慢，然后迅速上升直至达到峰值并趋于稳定（图3）。发酵液的pH是微生物发酵的综合结果。Val-A可以与氢离子结合，导致发酵液中氢氧根离子比例上升(Bai et al.,2006)。因此，在发酵后期，当Val-A大量合成时pH上升。在pH冲击组中，菌丝体首先自然培养20小时，并在pH 8.0时进行碱性pH冲击。然后，pH在短时间内迅速下降，这是由胁迫响应引起的。最终，pH在60小时后恢复，用于后续发酵。此外，Val-A在酸性条件(pH<5.0)下可被水解(Jin et al.,2006)，因此发酵pH的升高也有利于Val-A的积累和稳定。

胞内pH对于微生物的生长和代谢至关重要，它可以影响营养物质的吸收和利用、蛋白质合成、线粒体呼吸、碳水化合物代谢和其他重要的生命活动(Cotter et al.,2001)。因此，只有维持胞内pH的稳定，才能保证微生物的正常生长和代谢。如图3所示，在整个发酵过程中，胞内pH略有上升，从开始的7.21到最后7.73。Corvini等人(Corvini et al.,2004)也使用BCECF-AM荧光探针测定普拉特链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)的胞内pH，其范围在6.5至8.5之间。还发现基因SHJG7463编码

阳离子转运ATP酶在DNA微阵列中高表达，表明阳离子转运加速以中和pH的变化。此外，将氢离子转运进出细胞膜会消耗大量ATP，这也解释了下面关于菌丝体呼吸活性的现象。另外，应该注意的是，三羧酸循环导致胞外pH上升，而糖酵解和谷氨酸的合成通常导致酸化。因此，pH冲击组中的pH波动可能是碳水化合物和氨基酸代谢快速消耗的综合结果。

3.3.pH冲击引起的基因表达全局变化

使用倍数变化2且p<0.5的统计标准，在菌株5008中共鉴定出146个pH冲击下的差异表达基因(DEGs)（表1）。pH冲击下显著差异表达的基因主要分配于代谢、细胞过程和信号传导以及信息储存和处理相关的功能。正如预期的那样，除糖基转移酶基因valG外，大多数Val-A生物合成基因的转录水平在pH冲击下均增强。

在代谢相关的DEGs中，基因SHJG7463编码细胞膜上的阳离子转运ATP酶。这些基因的上调表达表明链霉菌细胞中的转运蛋白能够及时响应pH冲击，这有利于营养物质的吸收和次级代谢产物的分泌，并且相关的阳离子转运蛋白基因与链霉菌发酵过程中的pH变化和呼吸链密切相关。编码谷氨酰胺合成酶的SHJG3702上调。这与Gu的研究一致，该研究证明谷氨酰胺和3-氨基-5-羟基苯甲酸可以显著提高Val-A的产量，并且谷氨酰胺合成酶活性与Val-A产量呈正相关。另一个DEG SHJG6704编码铵通透酶。Xia(Xia and Jiao,1986)发现，在Val-A合成过程中添加铵离子可以通过加速氮代谢来促进细胞生长。SHJG6704的上调表达为Val-A提供了更多的氮源，并促进了细胞生长。SHJG0557编码细胞色素bd型醌氧化酶。SHJG7814编码粪卟啉原III氧化酶和相关的Fe-S氧化还原酶。铁硫氧化还原酶、细胞色素和铁硫蛋白是细胞电子呼吸链的组成部分。SHJG0557和SHJG7814的上调表达意味着吸水链霉菌5008的呼吸发生变化，这是pH冲击的响应措施之一。

在细胞过程和信号转导相关的DEGs中，编码UDP-N-乙酰胞壁酸脱氢酶的基因SHJG3272上调了2.99倍，而编码细胞分裂蛋白FtsI/青霉素结合蛋白2的基因SHJG3894和SHJG3896以及几个细胞壁水解酶基因则下调。这些基因与细胞壁合成有关，表明在pH冲击下细胞壁合成过程得到加强。

在信息储存和处理相关的DEGs中，大部分是转录调控因子，它们在次级代谢产物合成的调控中发挥作用，也表明吸水链霉菌5008通过复杂的信号转导系统响应pH冲击。原核生物的基因转录需要由核心酶和σ因子组成的RNA聚合酶。核心酶由α2ββ'ω等亚基组成。编码RNA聚合酶ECF亚家族σ因子的基因SHJG6022显著上调。在天蓝色链霉菌中，双组分调控系统CseB/CseC影响σE的活性(Paget et al.,2002)。环境胁迫信号由双组分系统传导。该系统与σE的启动子结合，然后通过与核心酶的相互作用激活转录。因此，推测双组分系统和σE的相互作用也可能参与吸水链霉菌5008，可以传递pH胁迫信号并调控参与Val-A生物合成的基因的表达。

简而言之，这些DEGs主要与氨基酸代谢、细胞过程和信号转导以及信息储存和处理相关。此外，通过qRT-PCR分析验证了关键基因的动态变化。在转录变化方面，DNA微阵列和qRT-PCR分析之间显示出良好的一致性，表明了微阵列数据的可靠性。可以推测，在胞外pH冲击下，细胞壁接收到的胁迫信号通过双组分系统进行转导。然后由双组分系统调控的ECFσ因子将与核心酶一起作用于下游基因并激活细胞防御系统。最终，营养物质和离子转运加速，导致葡萄糖代谢、氨基酸代谢、呼吸链和其他生理活动的变化，同时也缓解了碱刺激并促进了Val-A的生物合成。

3.4.Val-A发酵过程中呼吸活性的变化

如图4所示，两种策略下的菌丝体呼吸活性在接种后均下降，这可能归因于程序性细胞死亡。36小时后，由于蛋白质快速合成和细胞积累增多，pH冲击组的呼吸活性持续增加12小时，然后开始下降。微生物呼吸链成分的基础是NAD、FAD、FAM、铁硫蛋白(Fe-S)、泛醌（辅酶Q）和细胞色素系统。基因SHJG0557编码细胞色素BD氧化酶，SHJG7814编码铁硫氧化还原酶，这些酶是呼吸链的基本组成部分。可以推测，在pH冲击后，呼吸电子传递链中的酶活性增强，因此电子传递和呼吸加速以产生更多能量，这对Val-A合成至关重要。

3.5.pH冲击对氮代谢的影响

图5.pH冲击后5008的氮同化途径和胞内游离谷氨酸的变化。

先前的研究报道，通过使用氮同位素标记方法，谷氨酸可能是氮桥的主要来源(Mahmud et al.,1999)。根据Hodgson的报告(Hodgson,2000)和KEGG，吸水链霉菌5008的氮同化途径如图5所示。当氮源充足时，铵被谷氨酸脱氢酶催化成谷氨酸。当缺乏氮源时，铵主要被谷氨酰胺合成酶(GS)催化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺转化为谷氨酸。谷氨酰胺和谷氨酸都参与了Val-A生物合成的一系列反应过程。微阵列和qRT-PCR的结果表明，基因SHJG3702和SHJG6704均上调。随后，我们发现pH冲击组胞内谷氨酸浓度是对照组的2.82倍（图5），表明在pH冲击下铵离子转运加速，从而产生更多的谷氨酰胺和谷氨酸。显然，细胞处于相对高氮的环境中，而Val-A合成正在进行中，因此更多的氮前体（谷氨酸）有利于Val-A的合成。此外，以往在多种微生物中的研究表明，输入的肽可分解为游离氨基酸，形成重要的质子来源(Giotis et al.,2010)。谷氨酸是酸性氨基酸，增加的谷氨酸除了提供氮源外，还可以缓解碱的压力。

4.结论

碱性pH冲击显著提高了Val-A的产量27.43%。结合DNA微阵列，研究了其对细胞呼吸活性和细胞内微环境的影响，揭示了链霉菌对pH冲击的细胞响应机制（图6）。pH冲击加速了质子转运并增强了细胞的呼吸活性，从而为细胞生长提供了更多能量。而这一过程中酸性氨基酸的形成为有效霉素的合成提供了更多的氮前体。因此，上述因素的共同作用提高了Val-A的产量。显然，在链霉菌发酵中应更加重视碱性pH冲击。

致谢

本研究得到浙江省公益性项目(2016C32007)、国家重点研发计划项目(2016YFD0401201)、浙江省科协青年人才培育项目(2016YCGC004)和国家自然科学基金(20906060)的资助。