2.4.胞外和胞内pH测量

胞外pH(pHex,培养基pH)使用pH微电极计(Unisense,Denmark)测量。

胞内pH(pHi)使用pH敏感染料2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯(2',7'-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester,BCECF-AM；碧云天生物技术研究所，中国江苏)进行测量。本研究采用双激发比率法，使用多扫描光谱仪(SpectraMax M5,CA,USA)；激发波长分别为440nm和488nm，发射波长为535 nm。使用离子载体尼日利亚菌素(nigericin,Sigma,Lezennes,France)和一组pH值在6.5至8.5之间的确定pH的高K⁺磷酸盐缓冲液进行体内校准(Corvini et al.,2000)。

2.5.DNA微阵列实验和微阵列数据分析

使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN,Hidden,Germany)按照制造商的说明分离和纯化总RNA，并使用安捷伦2100生物分析仪系统(Agilent,CA,USA)检查其质量和数量。总RNA使用Low Input Quick Amp Labeling Kit,One-Color进行扩增和标记。Cy3标记的cRNA使用RNeasy Mini Kit进行纯化。在杂交炉(Hybridization Oven)中杂交17小时。杂交后，使用Gene Expression Wash Buffer Kit清洗芯片，并使用安捷伦微阵列扫描仪G2565CA扫描微阵列。

使用Feature Extraction Software 10.7对阵列图像进行采集和量化，并使用Quantile算法对原始数据进行归一化。计算每个基因的归一化表达比率，并使用倍数变化

2.0和p<.05的标准进行显著性检验。统计检验(t检验)中p值最低的变化值被视为最可靠的。为了表示每种培养条件下三个重复测量值（每个有一个技术重复）的变异，计算了变异系数(CV)。在样品中，至少98%的基因组产生可检测的转录本，平均变异系数不超过0.15，符合安捷伦的质量控制建议。

2.6.通过定量实时RT-PCR验证微阵列数据

使用Trizol(Invitrogen,CA,USA)提取总RNA，并用gDNA Eraser(Takara,Dalian,China)处理。随后，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara,Dalian,China)进行反转录。使用SYBR Premix Ex TaqTM(Ti RNaseH Plus)(Takara,Dalian,China)在StepOne Real-Time PCR(Applied Biosystems)上测定基因的转录水平。PCR条件为：95°C预变性10分钟，然后在95°C变性15秒，58°C退火60秒，72°C延伸15秒，共40个循环。对于每个基因，种子阶段的发酵样品被定义为表达水平1.0，结果表示为相对于对照样品mRNA水平的倍数增加(Feng et al.,2016)。

2.7.胞内游离谷氨酸浓度的测定

使用HPLC，采用茚三酮比色法测定在37°C(220 rpm)下培养两天的菌株5008的胞内游离谷氨酸。从发酵培养基中不同时间点取出的生物量样品在12,000g下离心5分钟，洗涤两次，重悬于1 mL ddH₂O中，并在冰浴中超声破碎（20个循环，每次超声5秒，间隔10秒）。在9000g下离心10分钟去除细胞碎片，然后将上清液与10%磺基水杨酸混合，在-20°C下放置20分钟，并在12,000g下离心60分钟。然后，提取物蒸发，用1mL 0.02 mol/L HCl重悬，并用0.22μm水相滤膜过滤(Wu et al.,2012)。将每种样品20μL注入HPLC进行谷氨酸测定。

2.8.CTC染色

5-氰基-2,3-二对甲苯基四氮唑氯化物(5-cyano-2,3-ditolyl-tetrazolium chloride,CTC)是一种可溶且不发荧光的染色剂。它可被呼吸细胞的电子传递链吸附并还原成不溶的红色荧光物质(CTC formazan)，并在细胞内积累。因此，这种氧化还原染料已被广泛用于测定细菌的呼吸活性。荧光强度越高代表呼吸活性越高。将菌丝体从摇瓶中在12,000g下离心5分钟收集，洗涤两次并重悬于盐水(0.9%NaCl)中。使用Bacstain-CTC快速染色试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)在1.5 mL离心管中按照说明书进行CTC染色，在37°C染色30分钟(Winding et al.,1994)。将200μL染色样品置于96孔板中，在激发波长488 nm、发射波长620 nm至640 nm下使用多扫描光谱仪(SpectraMax M5,CA,USA)进行测量。

3.结果与讨论

3.1.pH冲击对Val-A产量和细菌生长的影响

在初步筛选pH后，pH冲击在8.0时效果最佳。分别向发酵液中加入三种常见的碱液。发现两种有效的添加剂氢氧化钠和氨水，而磷酸盐缓冲液则具有相反的效果（图1a）。这与一些文献报道一致，这些文献记载过量的无机磷酸盐通常会抑制次级代谢产物的生产(Sola et al.,2003)。因此，所得结果表明pH冲击有利于Val-A的生产。氢氧化钠组的Val-A产量最高，因此选择氢氧化钠用于进一步研究。关于pH冲击的合适时间点，选择4 h-24 h内的5个时间点作为最旺盛的时期（图1b）。当碱性冲击时间晚于24小时时，该处理对Val-A产量没有显著影响，图中未显示。很明显，第20小时是pH冲击的最佳时间。在4 h-12 h加入氢氧化钠时，细胞仍处于生长早期，碱液的刺激在一定程度上阻碍了细胞的生长，因此pH冲击没有明显效果，甚至降低了Val-A的产量。至于不同的处理次数，发现多次pH冲击的效果未达预期（图1c）。在Val-A合成过程中，发酵液的pH会持续上升，这使得多次pH冲击的效果不如单次pH冲击显著。总之，最佳条件是在第20小时向发酵液中加入氢氧化钠溶液，而过多的无机磷酸盐对Val-A生产有阻碍作用。

pH冲击对吸水链霉菌5008的细胞重量有显著影响，在96小时时从6.00 g/L增加到6.60 g/L（图2）。发酵24小时后，pH冲击组的细胞积累量更高，并且pH冲击组的细胞生长速率快于对照组。这一现象表明pH刺激了链霉菌的代谢，在一定程度上加速了其生长，同时伴随着Val-A的大量合成，产量提高了27.43%。在第四天，pH冲击组的Val-A产量和产率（13.29 g/L;2.01 g/g蛋白）均高于对照组（10.78 g/L;1.80 g/g蛋白）（图1c和图2）。可以推测前体在发酵早期积累，然后这些前体被用于合成Val-A。Val-A产量的增加是生物量增加和产物增加的共同作用结果。

糖的消耗反映了链霉菌的能量代谢。Val-A合成的碳源前体是磷酸戊糖途径上的景天庚酮糖-7-磷酸(Degwert et al.,1987;Toyokuni et al.,1987)。pH冲击组第一天的糖消耗速率[2.23 g/(L·h)]快于对照组[1.91 g/(L·h)]，并且pH冲击组的细胞代谢活性相对较高（图2）。这主要是由于碱刺激使细胞加速利用碳水化合物产生酸以恢复pH。此外，发酵液中糖的消耗为细胞生长提供了能量，这与生物量的增加相一致。