摘要

有效霉素A(Val-A)是链霉菌产生的次级代谢产物，在控制水稻纹枯病、稻曲病和猝倒病方面具有广泛的农业应用价值。本研究探讨了碱性pH冲击对增强Val-A产量的影响及其机制。通过一次或多次NaOH冲击处理，结合更快的蛋白质合成和糖消耗，实现了更高的Val-A产量；碱性pH冲击可使Val-A产量提高27.43%。与氨基酸代谢、碳代谢和电子呼吸链相关的基因转录显著上调，同时伴随着呼吸活性和谷氨酸浓度的大幅增加。Val-A的产量受到一系列复杂机制的促进，并响应pH胁迫信号，这导致了谷氨酸代谢和呼吸活性的增强。所获得的信息将有助于未来抗生素产量提高的研究以及分子机制的深入揭示。

1.引言

抗真菌抗生素有效霉素A(Val-A)由工业菌株吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)发酵产生，在东亚已被广泛用作控制水稻纹枯病、稻曲病和猝倒病的首要药剂。提高Val-A产量的研究备受关注，但似乎对提高生产效率作用有限。pH是微生物代谢的综合反映，从而影响发酵过程和细胞生长。pH可以影响代谢方向，不同阶段生长和产物合成的最适pH也不同。相同的微生物在不同的环境pH条件下可能产生不同的代谢产物。例如，在pH 2-3条件下，黑曲霉（Aspergillus niger）发酵蔗糖的主要产物是柠檬酸，但当pH变为7时，主要产物是草酸(Lu et al.,2016)。因此，在发酵过程中，采用适当的策略控制pH可以获得所需的产品。

发酵pH对链霉菌的发酵也有很大影响，其中一些链霉菌具有特定的响应措施。不同抗生素的合成需要不同的pH，即使是同一种抗生素，在不同的培养阶段也需要不同的pH才能获得最高产量。根据Chan的研究(Chan et al.,2015)，提出了一种两阶段pH控制策略，即在培养112小时后将培养pH从5.5调整到5.8，以提高恩拉霉素（enduracidin）的产量，生产效率提高了51.2%。再例如，通过基于原位pH监测的种子阶段优化，ε-聚-L-赖氨酸的产量最多提高了36.6%(Sun et al.,2015;Xu et al.,2015)。

环境胁迫一直是促进链霉菌次级代谢产物的关键方法，环境信号可以通过启动复杂的转导系统来提高次级代谢产物的产量(Li et al.,2016)。链霉菌基于不同类型的环境因素，具有许多独特的信号转导机制。在天蓝色链霉菌A3(2)(Streptomyces coelicolor A3(2))中，pH冲击诱导了放线紫红素（actinorhodin）生产的调控基因和生物合成基因的过表达(Kim et al.,2007,2008)。此外，在链霉菌sp.CK4412(Streptomyces sp.CK4412)中，推定的酸冲击诱导基因SCO7832的表达通过途径特异性调控基因的过表达刺激了tautomycetin的生产(Park et al.,2009)。此外，双组分调控系统也是一种非常重要的调控方式。据报道，双组分系统DraR/DraK参与了天蓝色链霉菌中抗生素生物合成的调控(Yeo et al.,2013)。在白色链霉菌M-Z18(Streptomyces albulus M-Z18)中，研究了高ε-聚-L-赖氨酸生产对酸性pH的生理响应，与转录调控、胁迫响应蛋白、转运蛋白、细胞壁和细胞膜、次级代谢产物生产、DNA和RNA代谢以及核糖体亚基相关的基因在酸性pH响应中起主要作用(Ren et al.,2015)。然而，关于pH冲击对Val-A产量和生物合成途径中基因表达影响的信息很少，而这些信息对于改进抗生素发酵和降低成本具有重要价值。直到最近，我们首次采用碱性pH冲击来增强Val-A的产量，并且初步确定pH冲击的适宜pH约为8.0(Zhou et al.,2016)。

本研究旨在探讨pH冲击对Val-A发酵过程的影响，并揭示pH与Val-A产量之间的关系。基于吸水链霉菌5008在不同pH冲击条件下合成Val-A的产量变化规律以及最新的基因组研究进展，研究了pH对基因表达的影响及其在生理水平上的规律，以探索pH冲击提高Val-A产量的机制。首先，选择pH作为环境胁迫，从代谢活性分析角度提高Val-A产量，并构建了结合pH冲击的高效发酵策略。此外，依次探讨了pH冲击对基因表达和细胞微环境的影响。最后，全面讨论了pH冲击对Val-A生产的机制。据我们所知，这是在Val-A发酵中采用环境胁迫的首次尝试。它也可为其他放线菌生产抗生素提供良好的参考。

2.材料与方法

2.1.微生物与发酵条件

所用菌株吸水链霉菌5008(Streptomyces hygroscopicus 5008)(CGMCC 4.1026)是工业上Val-A的生产菌株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

孢子形成琼脂培养基包含：豆粕20 g/L，麦芽糖20 g/L，琼脂20 g/L。培养基用2mol/L NaOH调节至pH 7.0，并于121°C高压灭菌20分钟。在37°C培养八天后收集孢子，悬浮于20%(v/v)甘油中，并于-80°C保存备用。

种子培养基组成：玉米粉30 g/L，豆粕22 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 2 g/L，KH2PO4 0.8 g/L。接种50μL孢子悬浮液(1.5 x 10⁹cfu/mL)后，在250mL摇瓶（含50 mL种子培养基）中，于37°C，220 rpm的旋转摇床上进行预培养。

对于Val-A生产，发酵培养基包含：玉米粉100g/L，豆粕25g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 1g/L，KH2PO4 1.5g/L。将5mL种子培养物接种到含有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，在37°C和220 rpm下发酵5天(Zhou,et al.,2012;Zhou and Zhong,2015)。

2.2.提高Val-A产量的pH冲击策略

2.2.1.不同碱液进行pH冲击

当发酵进行24小时时，分别向不同处理组的发酵液中加入2 mol/L NaOH、2 mol/L KOH和2 mol/L氨水，将发酵液的pH从自然pH 6.4调整到pH 8.0。

2.2.2.不同时间点进行pH冲击

六个不同处理组的发酵分别进行4 h、8h、12h、16h、20h和24h，然后向发酵液中加入2 mol/L NaOH将pH调整至pH 8.0，继续进行培养。

2.2.3.不同处理次数

三组设置如下：

一次pH冲击处理：当发酵进行20 h时，向发酵液中加入2 mol/L NaOH将pH调整至pH 8.0。

两次pH冲击处理：当发酵进行20 h和44 h时，向发酵液中加入2 mol/L NaOH将pH调整至pH 8.0。

三次pH冲击处理：当发酵进行20 h、44 h和68h时，向发酵液中加入2 mol/L NaOH将pH调整至pH 8.0。

2.3.细胞重量、残余碳源和Val-A产量的分析

每天取2mL发酵液样品用于分析细胞重量、残余碳源和Val-A产量。样品在12,000g下离心5分钟。取0.5mL上清液用等体积氯仿萃取，然后用0.22-μm亲水性滤膜过滤。含有Val-A的过滤样品采用高效液相色谱法(HPLC)分析(Iwasa et al.,1971)。由于种子培养基中的玉米粉和豆粕不溶，标准的干重法不可行，因此使用标准的Bradford法测量细胞内蛋白质以反映细胞生长(Kieser et al.,2000)。培养基中的总残糖作为碳源通过标准的苯酚-硫酸法测定(Liao et al.,2009)。