表5：饲喂以大麦青贮料为基础日粮的小母牛的表观全肠道养分消化率

表6：饲喂以大麦青贮料为基础日粮，增加添加强化生物炭的小母牛的氮平衡

表7：饲喂以大麦青贮料为基础日粮的小母牛的能量平衡

表8：饲喂以大麦青贮料为基础的日粮的小母牛的甲烷排放量，日粮中含有增加添加的强化生物炭

添加EB对养分消化率和氮平衡没有影响（P>0.17）（表5、6）。EB不会改变PD总产量、MP吸收量和MN流量（P=0.22）（表6）。能量平衡、产热量和甲烷产量（克/天、克/千克DMI和克/千克DMD）也未受EB的影响（P>0.20）（表7、8）

表9：饲喂含2.0%强化生物炭大麦青贮日粮的小母牛的液体(LAM)、固体(SAM)和粪便(FAM)相关微生物的α多样性指数

图1：弦图显示了与处理(对照和2.0%强化生物炭)和来源(SAM，固体相关微生物；LAM，液体相关微生物；FAM，粪便相关微生物)相关的门的相对丰度(%)。该刻度表示总的累积丰度。每根弦的宽度代表了与每种处理和来源相关的每一门的相对丰度。带*的类群表示有显著差异的类群。

图2:弦图显示了与处理(对照和2.0%强化生物炭)和来源(SAM，固体相关微生物；LAM，液体相关微生物)相关的属的相对丰度(%)。该刻度表示总的累积丰度。每根弦的宽度代表与每种治疗方法和来源相关的每个属的相对丰度。带*的家庭表示有显著差异的家庭。

观察到的OTU、均匀度和多样性在EB处理之间没有差异（P≥0.58），但在样本来源方面均有差异（P<0.01）（表9）。EB处理与样本来源之间存在交互作用（P<0.05），影响Spirochaetaes,Verrucomicrobia,Tenericutes and Elusimicrobia的相对丰度。EB使LAM和SAM中的Spirochaetaes数量增加（图1）。只有微囊藻的相对丰度在LAM中与EB一起增加。在LAM中，EB降低了Tenericutes的相对丰度，增加了Elusimicrobia的相对丰度。在LAM和SAM中，EB会降低Fibrobacteres的相对丰度（P=0.05）。EB与样本来源之间存在交互作用（P<0.05），影响了Prevotellaceae,Bacteroidales RF16 group,Bacteroidales BS11,Spirochaetaceae,和未培养的Verrucomicrobia的相对丰度（图2）。在EB的作用下，LAM部分中Prevotellaceae,Bacteroidales RF16 group,Bacteroidales BS11组和未培养的Verrucomicrobia的相对丰度都有所增加。EB在LAM和SAM中分别增加了63%和30.3%。强化生物炭降低了LAM和SAM部分中Acidaminococcaceae and Bifidobacteriaceae的相对丰度（P<0.05）。在FAM组分中，EB在门或科的水平上没有影响，但EB有增加Euryarchaeota相对丰度的趋势（P=0.06）。

讨论：

生物炭已被提议作为一种饲料添加剂，具有增强瘤胃发酵和减少肠道甲烷（CH4）产生的潜力。这项综合研究考察了EB对肉牛新陈代谢和微生物种群的影响。据我们所知，这是第一项分别使用16SrRNA测序和开环呼吸室检测EB对瘤胃和粪便微生物群及CH4排放影响的研究。

评估生物炭对瘤胃新陈代谢影响的一个难点是生物质来源的不同、热解持续时间和温度的变化以及可改变EB成分、孔隙率和化学性质的后处理改良所带来的可变性。虽然之前的研究发现稻壳生物炭能产生积极的反应，但本研究使用的是松树生物质炭，这是因为松树生物质炭在整个北半球都有大量供应。然而，Saleem等人和Winders等人使用的生物质都是松树，而且生物炭在表面积、体积密度和pH值方面仍然存在差异。这些因素可能会影响瘤胃内EB的活性以及微生物群和宿主动物随后的新陈代谢反应。

与对照组相比，强化生物炭对总挥发性脂肪酸浓度或其各自比例没有影响。这与Calvelo Pereira等人的研究结果一致，他们报告说，虽然生物炭的原始生物质（玉米秸秆与松树）和加入量（81克/千克DM与186克/千克DM）会改变体外的VFA比例，但这些比例与对照处理相比并无差异。McFarlane等人也发现，不同来源的生物炭（即黄杨、白松和栗橡）不会改变体外VFA的产生，但该实验缺乏对照。Saleem等人使用瘤胃模拟技术发现，随着大麦青贮饲料中EB含量的增加（最多占日粮DM的2.0%），总VFA以及乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐和支链VFA的产生呈线性增加。在本研究中，只有支链VFA异丁酸（缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸脱氨的副产物）在2.0%EB的作用下减少。在异脂肪酸浓度和MP合成方面观察到的变化与氨基酸脱氨和微生物氮流之间的关系一致。

0.5%EB中NH3-N浓度的降低与Garillo等人的研究结果一致，他们也指出，在喂养成熟山羊的高粗饲料中添加0.6%活性炭时，NH3-N浓度会降低。虽然Garillo等人报告了NH3-N产量的变化，但不同处理间的原生动物数量并无差异。相反，Saleem等人报告说，随着生物炭浓度的增加，NH3-N呈线性增加趋势（P=0.06），但这并没有改变原生动物的数量。本研究中观察到的原生动物减少现象被认为是EB非选择性吸附特性的结果，但这种相互作用导致原生动物减少的确切细胞机制尚待阐明。尽管NH3-N和异丁酸浓度的下降可能与EB介导的原生动物减少有关，但这种反应并未改变MP合成或OM消化率。

原生动物会捕食利用NH3-N作为蛋白质来源的细菌，因此原生动物数量的减少可能会通过丰富细菌蛋白质合成来改善瘤胃氮代谢。然而，本研究并未观察到明显的营养消化率提高。这一发现与Winders等人的研究结果一致，他们在饲喂含有3%DM生物炭的高饲草或高精饲料的犊牛时，没有观察到犊牛消化道总消化率的变化。与缺乏影响相反，Van等人发现，饲喂0.5克和1克/千克体重竹炭的生长山羊的DM、OM和CP消化率得到提高，氮的保留率增加。Van等人使用的山羊饲喂含有单宁酸的芒果相思树，这可能是造成不同研究之间差异的原因之一。喂养的山羊含有单宁酸。生物炭可以吸收有毒化合物，防止它们被胃肠道吸收。

2.0%EB的最低pH值升高，pH值变化减小，这可能是由于本研究中使用的EB具有碱性（pH值为7-8）。Van等人报告说，饲喂活性炭的山羊瘤胃pH值往往较高。此外，CalveloPereira等人报告说，用186克/千克DM的生物炭腌制的草在128天后pH值升高。CalveloPereira等人使用的生物炭的pH值介于9.16到9.89之间，由松树屑或玉米秸秆在350或550℃下热解产生。本研究中使用的EB由于采用了中和工艺，pH值为7-8，因此对瘤胃pH值的增加作用微乎其微。相比之下，Saleem等人使用了pH值为4.8的生物炭，但这并没有影响RUSITEC瘤胃内的pH值。

尽管在本研究中，EB并未影响肠道的CH4排放，但Leng等人报告说，稻壳生物炭使幼年肉牛的CH4产量减少了24.3%，活重增加了20.2%。同样，Saleem等人也报告说，在RUSITEC中，CH4的产生量减少了25.2%。关于生物炭如何促进瘤胃中CH4排放量的减少，人们提出了许多假设。其中包括生物炭的高表面积、多孔结构、高离子交换和吸收特性可促进生物膜的形成。然而，已知甲烷菌是瘤胃中生物膜不可或缺的成员，从理论上讲，生物膜发展的增加实际上会导致瘤胃中CH4产量的增加。此外，根据电子显微镜观察，在生物炭上形成的表面生物膜似乎比在谷物等容易消化的饲料表面形成的生物膜要不发达得多。

也有人提出，生物炭可以增加产甲烷菌的丰度，抑制产甲烷菌，或吸收瘤胃内产生的CH4。不过，这一点还有待评估。甲烷营养体能够在与硫酸盐、硝酸盐或金属氧化物的还原反应中厌氧氧化CH4。瘤胃中是否存在甲烷营养体以及甲烷营养体的相对重要性仍存在争议，因为研究发现瘤胃中不存在甲烷营养体或甲烷营养体含量极低。除了与甲烷氧化相关的代谢途径外，甲烷营养体也有可能从其他代谢途径获取能量。此外，日粮中低浓度（0.3-3.0%DM）的生物炭吸收瘤胃中产生的大量CH4的可能性似乎不大。同时，在SAM和LAM中，EB在门、科或属一级对产生CH4的微生物--古细菌没有影响，这表明在给药浓度下，EB对甲烷菌也没有直接毒性。Winders等人的研究与我们的研究结果一致，他们发现以0.8%或3.0%的DM量饲喂全松树生物炭并不会降低生长期或育成期饲料中母牛的甲烷产生量。

虽然EB没有改变α-多样性指数，但它确实引起了几个门和科的变化。纤维细菌被认为是瘤胃中主要的木质纤维素降解菌，EB使其在LAM和SAM中的丰度下降。螺旋体，另一个假设扮演EB在LAM和SAM中均增加了复合纤维降解的作用。有趣的是，对EB处理有反应的所有其他门类都与液体有关，这可能是EB微粒在瘤胃内容物液体部分中分散的反映。瘤胃微生物群中的瘤胃微生菌（Verrucomicrobia）、瘤胃单胞菌（Tenericutes）和瘤胃拟杆菌（Elusimicrobia）通常是次要成员，它们在瘤胃中的作用尚不清楚。拟杆菌科（Prevotellaceae）是瘤胃微生物群中的优势科，EB会增加它们的数量。同样，EB也增加了瘤胃中另外两个类杆菌科（类杆菌RF16组和类杆菌BS11肠道组）的数量。EB减少了属于固有菌门的酸性氨基球菌科（Acidaminococcaceae），该科的代表是琥珀酸菌属（Succiniclasticum），已知该菌可将琥珀酸发酵成丙酸。EB使属于放线菌门的双歧杆菌科在LAM和SAM中的数量减少了64.0%。在纤维较多的膳食中，双歧杆菌科微生物的数量有所增加，可能参与了植物衍生复合碳水化合物的代谢。尽管这些微生物种群发生了变化，但似乎与瘤胃发酵或新陈代谢中可量化的变化无关。

在土壤中，添加30兆克/公顷-1的生物炭不会改变生物群（细菌、真菌、原生动物、线虫和节肢动物）。此外，通过缓慢热解产生的生物炭（0.5%土壤DM；15吨/公顷）也没有改变微生物数量或群落结构，但在培养720小时后，真菌的数量有所增加。这可能是由于真菌具有降解难降解饲料的能力。另外，一项荟萃分析研究发现，短期和长期施用生物炭后，改良土壤的微生物丰度和多样性都有所提高。与土壤相比，生物炭在瘤胃中的停留时间较短，因此微生物的结果预计会有所不同。

要估计EB在瘤胃微生物群中的作用程度，还需要进一步的研究。总体而言，与液体相关的微生物受EB的影响大于与瘤胃微生物相关的微生物，这表明瘤胃微生物会被动地困在EB的多孔结构中。另外，SAM已经与饲料颗粒紧密结合，不会直接暴露在EB中。尽管日粮中添加EB后粪便的颜色发生了显著变化，但粪便中的细菌数量没有变化。有趣的是，尽管有报道称经生物炭处理过的粪便在堆肥过程中会减少CH4的排放，但FAM中的Euryarchaeota有增加的趋势，而Euryarchaeota是与产生CH4的古细菌相关的一个门类。

总之，EB不会改变瘤胃发酵、CH4产量或表观总消化率。