表观总消化率：

为了测定营养物质的表观总消化率，在每个实验期的第18天至第22天，进行了4次24小时的尿液和粪便收集。母牛被饲养在单独的收集栏中，并安装了留置导尿球囊。粪便收集在放置在每头小母牛身后的盘子里。每天从每头小母牛身上采集10%的粪便子样，并按期内小母牛进行合成。将具有代表性的样本（500克）在55℃下干燥96小时，以测定DM。尿液收集在预装4NH2SO4（500mL）的密闭收集容器中，以防止NH3-N的挥发。每天采集一份2%的酸化尿样，然后按母牛的周期进行合成。尿液子样以1:5的比例用蒸馏水稀释，并储存在-20℃温度下，直至分析。

血液采样：

第22天，在饲喂前和饲喂后6小时从母牛颈静脉采集血样。采血时使用两个10mL含肝素锂的真空管，用于血浆尿素氮（PUN）分析。试管在4℃温度下以2,000×g离心20分钟，然后将血浆转移到微管中，在-20℃温度下冷冻，直至分析。

反刍动物pH值记录仪：

第25天，将pH记录器放入每头母牛的腹腔，以测定瘤胃pH值。使用LRC pH数据记录器系统记录瘤胃pH值，从第25天到第27天，每隔1分钟记录一次。记录仪在使用前后使用pH4和pH7缓冲液进行了标准化处理。

箱体测量：

为了测量CH4排放量，将母牛分别饲养在4个开放式呼吸室（宽4.4m×深3.7m×高3.9m，容积63.5m3 MB）中。第26天，母牛被转移到受控环境建筑物中，并被带入分配给它们的饲养室，在那里立即喂食，并关闭饲养室的门。母牛在小室中饲养3次，每次24小时，每天打开小室一次，以便喂食和清洁。Beauchemin和McGinn对方法和排放计算进行了详细描述。在研究开始之前和之后，都对样品室进行了校准，并每天对仪器进行校准。不同样品室的斜率差异小于5%，回收率在98%到106%之间。

化学分析和计算：

饲料、饲料残渣和粪便样品在55℃下烘干，以测定DM，然后通过1mm筛磨。对样品进行分析，以测定DM方法、OM、灰分、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）。灰分含量通过在马弗炉中于550℃下燃烧5小时测定。样品按顺序进行NDF和ADF分析方法，并对纤维分析仪进行修改，在NDF分析程序中加入热稳定的α淀粉酶和亚硫酸钠，NDF表示不包括残留灰分。

为了测定淀粉和氮的含量，将干饲料和粪便的子样品在球磨机中研磨。饲料、拒食饲料、粪便和尿液中的氮采用闪燃气相色谱法和热导检测法定量。粗蛋白（CP）以N×6.25计算。淀粉的测定方法如下Herrera-Saldana等人。使用淀粉葡萄糖苷酶和1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶的混合物水解α-葡萄糖聚合物。葡萄糖样品的吸光度在Thermo Scientific Appliskan1.437微孔板阅读器上以490纳米的波长读取。饲料和粪便样品的总能量含量用炸弹热量计测定。

溶解的H2是用氢气电极（H2-500；Unisense，丹麦奥胡斯）测量的，电极连接在一个玻璃流通池（内径2毫米，外径6毫米）上。H2电极与微型传感器万用表（Unisense，丹麦奥胡斯）相连。传感器的校准方法与Guyader等人所述相同。按照Dehority的描述，使用深度为1毫米的Levy-Hausser计数室在光学显微镜下对原生动物进行计数。使用气相色谱仪测定瘤胃中的挥发性脂肪酸，气相色谱仪配有30米长的Zebron游离脂肪酸相熔融石英毛细管，内径0.32毫米，膜厚1.0微米。

NH3-N的浓度是按照Broderick和Kang所述的次氯酸苯酚法测定的。血浆中尿素氮的浓度是用微分流量分析仪，尿囊素的测定方法由Young和Conway描述，尿酸浓度的测定方法是使用商业试剂盒。

微生物氮合成量的估算采用了Chen和Gomes提出的计算方法：

其中，嘌呤衍生物总量（PD）是尿囊素和尿酸排泄量的总和（毫摩尔/天）。微生物流量（克N/天）的计算公式为：

制热量（HP）是根据Brouwer提出的公式，利用3天试验室测量中消耗的氧气以及产生的甲烷和二氧化碳（CO2）的平均值计算得出的：

瘤胃微生物群落：

只有使用对照组或2.0%EB处理的母牛样品才用于微生物分析。样品经冷冻干燥后用咖啡研磨机研磨。使用Zymobiomics DNA提取试剂盒从0.1克冷冻干燥研磨样品中提取DNA。通过使用NanoDrop分光光度计测量260/280和260/230吸光度的比率，确定提取的元基因组DNA的浓度和纯度。使用引物27F和1398R进行PCR反应，扩增全长16srRNA基因，以确认样品中不存在PCR抑制剂。

测序工作在麦吉尔大学和魁北克基因组创新中心进行，使用的是Illumina MiSeq Reagent Kit v2，遵循了制造商的指导原则。515F引物和806R引物靶向16srRNA基因的V4区域，用于检测细菌和古细菌的多样性。使用1µL1比10稀释的基因组DNA和快速启动高保真PCR系统进行33个循环的PCR，条件如下：94℃2分钟，然后进行33个循环：94℃30秒，58℃30秒，72℃0秒，最后在72℃7分钟进行延伸。使用FastStart高保真PCR系统在以下条件下将Fluidigm公司的条形码纳入第二个PCR反应：95℃10分钟，然后进行15个循环：95℃15秒，60℃30秒，72℃1分钟，最后在72℃下延伸3分钟。扩增后，在2%琼脂糖凝胶中评估PCR产物，以确认扩增是否充分。所有样本均使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析试剂盒进行量化，并按等比例汇集。然后使用校准过的Ampure XP珠子对汇集的样本进行纯化。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析试剂盒和Kapa Illumina GA with Revised Primers-SYBR Fast Universal试剂盒对汇集的样本（文库）进行量化。使用LabChip GX仪器测定平均片段大小。

将原始fastq文件导入Qiime2进行序列分析。使用插件cutadapt从序列文件中移除引物和适配器序列。移除引物和适配序列后，使用程序dada2进行质量控制，过滤测序数据中的任何phiX读数，并移除嵌合序列。Dada2模型用于纠正Illumina序列数据中的错误，并生成一个包含菌株级分辨率序列计数数据（丰度）的特征表。在Dada2之后，使用Mafft程序进行多序列比对，并屏蔽高变异区域。用FastTree生成系统发生树。使用使用Silva128参考数据库和特征分类器插件训练的朴素贝叶斯分类器将分类分配给序列。为确保α和β多样性分析使用相同数量的序列，对所有样本中的最低序列数进行了子采样。多样性插件core-diversity-metrics用于评估样本内部（α-多样性）和样本之间（β-多样性）的微生物多样性。对α-多样性、系统发育多样性、观察到的OTU数量、均匀度和分类丰度进行了评估。使用加权和非加权UniFrac进行了β-多样性分析。序列已存入Small Reads Archive，登录号为PRJNA534330。

统计分析：

数据使用SAS的MIXED模型程序进行分析。单变量程序用于验证数据是否呈正态分布。在进行统计分析前，对原生动物计数进行对数10转换，以符合方差均一性。所有变量的数据均以小母牛为实验单位进行分析，但CH4测量除外，因为每头小母牛在每个时期都饲养在同一试验室内，所以试验室内的小母牛为实验单位。该模型包括EB作为固定效应，以及方形、方形内嵌套的小母牛和方形内嵌套的时期等随机效应。在微生物分析中，还包括来源（LAM、SAM、FAM）的固定效应以及处理与来源的交互作用。对于瘤胃变量和血液参数，小时被视为重复测量，对于瘤胃室和pH值记录仪测量，日被视为重复测量。使用SAS对连续的瘤胃pH数据进行总结，包括日平均值、最小值、最大值和标准偏差。在每个时期的4天内，计算每个试验室每天的累计CH4排放量。使用Akaike信息标准的最小值来选择适当的协方差结构。使用Tukey检验计算经错误发现率(FDR)校正的P值。当P<0.05时，宣布平均值之间存在差异，并使用对比声明来检验线性和二次效应，系数根据非等距处理结构进行调整。弦线图使用R Studio中的circlize软件包生成。

结果:

表3：饲喂以大麦青贮料为基础日粮的小母牛的干物质采食量和瘤胃发酵产物，其中大麦青贮料日粮含有增加添加的强化生物炭

各处理的干物质摄入量和总VFA浓度相似（P>0.21；表3）。饲喂0.5%和2.0%EB的母牛体内的乙酸浓度（P=0.01）高于饲喂1.0%EB的母牛。随着EB处理量的增加，异丁酸浓度和溶解的H2呈二次方下降趋势（P=0.09）。氨氮浓度呈二次方趋势（P=0.01），0.5%EB最初会降低NH3-N浓度，但对照组与1.0%和2.0%EB之间没有差异。

表4：饲喂以大麦青贮料为基础日粮，增加添加强化生物炭的小母牛原生动物数量和瘤胃pH

原生动物总计数呈二次下降（P<0.01），对照组的总计数高于所有浓度的EB（表4）。不同处理中Entodinium、Holotrichs和其他原生动物属的百分比没有差异（P>0.14）。当EB增加2.0%时，pH值的最小值和变化值呈二次方趋势（P<0.06）,最小的pH值和减少的pH值变化。