为了量化Geobacter生物膜深度方向上的实时pH分布，使用pH微电极获得了pH-深度剖面。它们在不同的电流水平下进行了测量，如图1中所示的红色箭头。pH微电极尖端首先放入批量溶液中，距离生物膜表面数千微米，然后逐步向下移动。3.4阳极表面附近和批量溶液中的pH变化

从图2可以看出，随着生物膜的生长，靠近阳极表面和溶液中的pH值逐渐降低。显然，随着电流增加，给定位置的实时pH值降低，这意味着随着时间的推移，在生物膜内积累了越来越多的质子。为了更清楚地看到这种趋势，图4(a)将其作为电流密度的函数呈现。在生物膜底部，电流密度为1.07 A m-2时，pH约为7.33，当电流密度增加到4.46 A m-2时，降至6.57，继续下降到7.93 A m-2时的6.12，并在440小时生长后的最大电流密度为10.71 A m-2时达到更低的值为5.72。然而，在此之后，生物膜底部的pH在衰减电流（10.23 A m-2）在455小时时降至其最低值为5.57。

当介质在482小时（10.70 A m-2）更换时，它略有上升至5.63。此外，在批量溶液中，pH水平也呈下降趋势。由于自由质子通过边界层从内部生物膜传输到批量溶液，它从1.07A m-2的7.40下降到10.23A m-2的6.90。总的来说，在厚度为350mm的Geobacter生物膜（10.23A m-2）附近检测到的pH水平为5.57，而批量溶液的pH为6.90。让我们再次返回到图4(a)。计算了批量溶液和阳极表面之间的pH差异。由于更大的电流密度和因此更厚的生物膜肯定会导致更重的质子积累，差异随电流密度增加而增加。可以发现，电流密度为1.27 A m-2时，pH差异仅为0.11 pH单位。它增加到5.89 A m-2时为0.63。如果电流密度为10.71 A m-2，则pH差异进一步增加到1.06，对应的批量层和生物膜底部的pH值分别为6.78和5.72。这意味着电极表面附近的质子浓度几乎比批量层高出11.5倍。还可以发现，pH差异几乎与电流密度线性增加（r2=0.98），如图S6所示。在长时间大电流操作后，pH差异达到了其最大值，在10.23 A m-2时为1.33单位，这意味着电极表面附近的质子浓度几乎比批量溶液高出20倍。

图4.阳极表面附近和批量溶液中的pH变化以及作为电流密度函数的pH差异（a）。Geobacter生物膜内平均pH变化曲线及各种电流密度下相应的质子浓度曲线，插图显示了电流密度和平均pH值之间的线性相关性（r2=0.99）（b）。

3.5 Geobacter生物膜内的平均pH

根据生物膜厚度和质子浓度深度剖面，可以通过以下方程计算Geobacter生物膜内的平均质子浓度，

例如，通过计算图2(f)中显示的阴影区域的积分，可以轻松计算出生物膜内的平均质子浓度。然后可以从中获得平均pH。通过这种方式，可以为不同电流密度条件下确定阳极生物膜内的平均pH。根据图2中的数据，计算得到的平均pH值分别为1.27 A m-2、2.58 A m-2、2.97 A m-2、5.89A m-2、7.93 A m-2、9.25 A m-2、9.83A m-2和10.23A m-2时分别为7.29、7.01、6.91、6.48、6.20、6.00、5.88和5.61。

图4(b)呈现了生物膜内平均pH的变化曲线以及相应的质子浓度曲线。可以看出，平均pH值随着电流密度的增加而降低，这仅仅是质子在生物膜内积累的结果。然后，在长时间大电流操作后，它跟随着一个大的降低。在此之前，揭示了在生物膜内平均pH值是电流密度的线性函数，其水平高达r2=0.99，如图4(b)中所示的插图。这一发现可以用来根据电流密度估算Geobacter生物膜的平均pH。还可以观察到，平均质子浓度随着电流密度稳步增加，然后跟随着一个大的增加。

还可以发现，生物膜内的平均pH随着生物膜厚度减小而减小。随着生物膜厚度从90mm增加到325mm，它从7.29降至5.88，然后在350mm厚的生物膜中急剧下降至5.61。这意味着检测到的自由质子在Geobacter生物膜内的积累增加了26倍（1.41 pH单位），与初始生物膜相比，生物膜厚度从90mm增加到325mm时，甚至增加到48倍（1.68 pH单位），证明在50mM磷酸盐缓冲条件下，350mm厚的生物膜内的质子不能有效地被输送出来。

3.6循环伏安法

在pH测量后记录了CV，如图S7所示。所有CV都显示了一个典型的S形状，类似于文献报道的Geobacter主导的生物膜中的乙酸氧化反应[19,20]的响应。CV的一阶导数用于检查中点电位，如图5所示。从这张图中可以看出，乙酸氧化的一个主要氧化还原对和中点电位随电流密度增加而略微向右移动。在1.27 A m-2时，中点电位为0.425 V vs.Ag/AgCl，平均pH值为7.29。随着电流增加到5.89 A m-2，它在0.357 V处，平均pH值为6.48。最后，中点电位在10.70A m-2时增加到0.328 V vs.Ag/AgCl，平均pH为5.71。从这些结果可以得出结论，随着生物膜内pH的降低，中点电位逐渐增加。图5中的插图描述了中点电位曲线与生物膜内平均pH的关系。进行了最小二乘回归，结果表明它们之间存在良好的线性关系。拟合线的斜率为59.0 mV每个pH移动，接近Nernst方程的理论值（每个pH 59.2 mV）。这种变化的主要原因可能是这里的电子转移过程是质子耦合或依赖的，这意味着细菌中电子转移的复杂机制与细菌新陈代谢中的氧化还原和质子泵机制相关，并且与pH相关[20,21]。因此，可以得出结论，Geobacter生物膜内平均pH的轻微变化将导致中点电位的大幅波动。反过来，中点电位的变化也检验了生物膜内的pH值随电流密度的持续变化。

图5.CV的一阶导数图（di/dV），插图显示了Geobacter生物膜内平均pH水平变化的中点电位。

3.7缓冲浓度对pH分布的影响

缓冲溶液始终用于减少生物膜团簇内的质子积累[22–25]。为了进一步评估缓冲浓度对Geobacter生物膜内pH分布和电流产生的影响，依次在不同缓冲浓度介质（50 mM、75 mM、100 mM、50 mM和25 mM）下进行了实验。50 mM溶液被喂入反应器两次，以确保Gerobacter生物膜的活性。在整个实验过程中，所有流入的pH均保持在约7.35 x0007 7.50。图S8显示了不同缓冲浓度条件下的电流曲线。50 mM、75 mM、100 mM、50 mM和25 mM磷酸盐缓冲流入的电流密度分别为10.73 A m-2、12.5 A m-2、16.50A m-2、9.80 A m-2和6.01 A m-2。

对于pH测量，对于每种缓冲条件选择了生物膜上的至少3个位置，测得的数据显示在图S9中。图6呈现了计算得到的平均pH分布。25 mM条件下，阳极表面附近的pH值约为4.91，明显小于50 mM、75 mM和100 mM的阳极表面附近的pH值，分别为5.31、5.82和5.73。这表明在低缓冲浓度条件下，质子不能有效地从生物膜中运出，细胞活性以及电流产生受到严重限制。经过576小时的培养后，从生物反应器中取出了覆盖有Geobacter生物膜的阳极。图S10是删除了电极表面一半生物膜的数字照片，以供比较。

图6.缓冲浓度（25 mM、50 mM、75 mM和100 mM）对Geobacter生物膜内pH分布的影响。误差线表示标准偏差。

4结论

本研究利用pH微电极调查了不同电流密度下Geobacter生物膜内的空间pH分布。在350um厚的Geobacter生物膜（10.23A m-2）中，与批量溶液的6.90相比，阳极表面附近检测到的pH水平低至5.57。在这里，pH差异达到了1.33个单位的最大值，这意味着电极表面附近的质子浓度几乎比批量溶液高出20倍。本研究还表明，在低缓冲浓度条件下，厚生物膜中的质子不能有效地被输送出生物膜。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金项目（No.51676004）的支持。