3结果与讨论

3.1 Geobacter生物膜生长

图1显示了在恒定电位下（与Ag/AgCl相比为0.1 V）基于碳布的Geobacter生物膜随时间的电流产生变化。红色箭头表示测量生物膜生长期间进行pH和CV测量的电流。从这张图中可以看出，电流密度在45小时接种后达到了1.07A m-2，如第一个红色箭头所示。随着细菌或生物膜的附着增加，电流密度呈上升趋势，直至256小时接种后达到5.89A m-2。此后，随着时间的推移，Geobacter生物膜的电力产生能力进一步提高。值得指出的是，在440小时生长后，最大电流密度惊人增长至10.71 A m-2。之后呈稳定下降趋势。然后在462小时时更换了新的阳极液并再次循环。可以看到，电流重新开始并在10.70A m-2达到最大值，几乎与之前的最大电流密度相等，这意味着长时间运行时，深层生物膜生长受到底物短缺或质子积累（低pH）的限制，这些对生物膜活性具有抑制作用。在576小时运行后，提取了呼吸阳极生物膜进行生物多样性分析。16S rRNA分析结果显示，Geobacter spp占74%，如图S3(a)所示。还进行了重复实验，结果清楚地显示，与此处的生物阳极得到了类似的电流密度，如图S1(c)所示。生物多样性分析表明，Geobacter spp在图S3(b)中占65%。

图1.在恒定施加电位（-0.1 V vs.Ag/AgCl）下的Geobacter生物膜生长情况。红色箭头表示用于pH和CV测量的各种电流密度（它们分别为1.07A m 2，1.27A m 2，2.58 A m 2，2.97A m 2，4.46 A m 2，5.89 A m 2，7.93 A m 2，9.25 A m 2，9.83 A m 2，10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2，分别为45小时，72小时，116小时，140小时，205小时，256小时，285小时，330小时，418小时，440小时，455小时和482小时）。

3.2 Geobacter生物膜内原位pH分布

为了量化Geobacter生物膜深度方向上的实时pH分布，使用pH微电极获得了pH-深度剖面。它们在不同的电流水平下进行了测量，如图1中所示的红色箭头。pH微电极尖端首先放入批量溶液中，距离生物膜表面数千微米，然后逐步向下移动。考虑到生物膜表面的不规则性，每个电流密度选取了至少3个位置进行pH测量，测得的数据见图S4。每个电流密度的平均pH-深度剖面计算并绘制如图2(a)–(e)所示。发现在每个pH-深度剖面中都存在一个靠近0mm处的小区域（图2中），在该区域中，测得的pH值变化很小或几乎保持不变。这表明微电极尖端已经进入到电极表面的附近。因此，可以假设这个小区域位于生物膜底部附近，即电极表面。在图2中，生物膜底部（电极表面）位于深度为0mm处。预期，随着微电极尖端从溶液（3500mm）向阳极表面（0mm）移动，pH逐渐降低，无论生物膜的年龄如何，都会发生这种情况。图2(f)展示了在7.93 A m-2下测得的一个pH-深度剖面及其相应的质子浓度深度（PCdepth）剖面。可以清楚地看到，pH曲线呈S形，PC曲线呈锯齿状。实际上，在所有实验中，“S”和“Z”形状的曲线始终存在。仔细观察图2(a)–(e)，可以看到沿深度方向的pH分布可以分为三个典型区域，即阳极生物膜、浓度边界层和批量溶液。由于它们具有不同的主要功能，这三个区域显示出不同的特性。众所周知，由于在批量溶液中没有微生物营养物去除和缓冲溶液的影响，在该区域中pH预计应保持在一个常数附近，这与生物系统中底物和/或氧分布的趋势相似。在图2中，一个陡峭的斜坡总是出现在750和1300mm之间的所有剖面中，实际上是位于边界层和批量溶液之间的界面，这种急剧下降也表明pH微电极尖端从批量溶液中穿过界面层，然后穿过界面层以及之后的电力生产生物膜。

图2.在电流密度为1.07A m-2和1.27A m 2时Geobacter生物膜内的平均pH分布，边界层和批量溶液（a）；在2.58 A m 2和2.97 A m 2时（b）；在4.46 A m 2，5.89 A m 2和7.93A m 2时（c）；在9.25 A m 2和9.83 A m 2时（d）；在10.71A m 2，10.23 A m 2和10.70A m 2时。误差线表示标准偏差。图2(f)是在7.93A m 2下测量的剖面之一，以及Geobacter生物膜内上方和内部的质子浓度剖面。

3.3 Geobacter生物膜的厚度

在生物电化学系统中，证明了质子主要通过对缓冲系统的共轭碱（即，HPO2 4þHþ!H2P4）质子化而从阳极生物膜中转运出来。使用pH微电极获得的pH数据实际上只反映了未络合的质子（自由质子）的浓度。Marcus等人开发了一个描述阳极生物膜建模的平台，描述了电中性、ARB半反应、扩散、迁移和酸碱化学的同时发生的现象。他们的结果显示，pH发展与边界层内的深度之间具有近似线性关系，并且在生物膜内具有指数关系，这与我们在图2中的实验结果非常一致。我们知道，当pH微电极开始从浓度边界层穿过生物膜时，pH值应该有最大的下降。因此，通过计算pH到深度的一阶导数，可以根据斜率趋势识别生物膜或界面的位置。通过这种方式，可以估算生物膜的厚度和边界层的厚度。

以7.93 Am-2的pH-深度剖面为例，选择了5个位置进行pH测量。它们的一阶导数图在图3(a)中呈现。将这些图的平均值作为插图显示的平均一阶曲线。可以清楚地看到，在批量溶液、边界层和Geobacter生物膜中，斜率完全不同。在批量溶液中，导数保持在零附近，因为此处的pH值大致是常数，然后导数远离零，反映出微电极逐步向下移动进入边界层。在那之后，它逐渐增加到pH/mm的斜率，直到获得最大斜率。可以发现，在边界层中，导数并不保持不变，这可能是由边界层中的游离细菌引起的。实际上，最大斜率的位置是阳极生物膜和边界层的界面。这是因为电流或质子H+实际上是在生物膜内产生的，并且底物在这个界面上接触到。可以预期，由于H+和底物的扩散效应，离开界面的位置的H+梯度和因此pH值的梯度趋向于减小。在Geobacter生物膜内部，斜率急剧下降，直到达到生物膜底部，因为内部的有效扩散系数减小。正如可以清楚地看到的那样，插图中的最大斜率的拐点位于约275mm的深度处，因此是生物膜厚度dbiofilm。代谢不活跃的生物膜层也可以通过在该区域检测到的pH值与活跃生物膜相比呈相反趋势来检测到。如图2(d)和图2(e)所示，在阳极表面附近，pH值要么保持在一个较低值的常数，要么随深度减小而减小。这表明，这里的质子主要是从外部活跃细胞传输的。这也解释了为什么这个区域的导数等于或小于零。

应该强调的是，我们实际上开发了一种方法来使用测得的pH-深度剖面估算生物膜的厚度，该方法从阳极表面延伸到批量溶液。为了更清楚地描述，该方法总结如下：

（1）借助pH微电极，在给定的生物膜生长阶段垂直于深度方向的不同位置获取沿深度方向的pH分布；

（2）使用在给定生物膜生长阶段获得的pH分布，计算pH对深度的一阶导数；

（3）从（2）中获得的一阶导数中计算平均一阶导数；

（4）将平均一阶导数根据深度绘制出来；

（5）定义平均一阶导数获得其最大值的深度为生物膜厚度或生物膜和边界层的界面。

（6）界面的右侧属于边界层和批量溶液之间。这个厚度是任意的。在这里，我们将该厚度定义为从其最大值减小到其最大值的1%所需的距离。

（7）生物膜可以进一步分为活跃部分和不活跃部分。不活跃部分的生物膜是靠近阳极的区域，其pH值非常小或呈负值。不活跃部分的厚度可以通过读取相应的pH-深度分布来确定。活跃部分的厚度等于生物膜厚度减去不活跃部分的厚度。

使用上述方法，获得了其他电流密度下的一阶导数图见图S5(a)-(h)。插图是每个电流密度的平均一阶曲线。图3(b)总结了包括不活跃部分和活跃部分的Geobacter生物膜厚度。从这张图中可以看出，生物膜厚度不断增加。在1.27 A m-2时约为90um，如果电流增加到2.97 A m-2，则为190um。在285小时的首次接种中它大幅增加，这意味着随着时间的推移，附着的细菌/生物膜增加了。在7.93 A m-2时达到了275um的厚度。之后，活跃生物膜的发展减缓，然后在9.25 A m-2时达到300um，周围有部分不活跃的生物膜层约为25um。我们发现，活跃生物膜层的厚度后来保持在约275um左右几乎不变，这表明由于阳极生物膜附近的底物或低pH的可用性，其厚度已经达到了最大值。因此，我们可以说，从阳极生物膜表面到顶部的275um，其产生质子并消耗乙酸的区域是新陈代谢活跃的。检测到的不活跃生物膜厚度在10.71 A m-2时增加到约50mm，在10.23A m-2时增加到约75mm。这个结果证明了靠近电极的细胞形成了密集的不活跃层，并且可能会限制乙酸或/和pH，因为已经证明与370um Geobacter生物膜内的外部生物膜相比，电极附近的有效扩散系数大大减小。但是，即使存在不活跃区域，生物膜的细胞外电子传递也不会受到阻碍，即使生物膜厚度达到数百微米，因为电导率足够大，可以使细胞在这个区域之间传输电子。这解释了为什么电流密度不会下降，即使存在不活跃区域。在本研究中，边界层厚度在450-650um范围内变化。

图3.在7.93A m-2下pH对深度的一阶导数图，插图显示了平均曲线，误差线表示标准偏差。（a）；各种电流密度下的生物膜厚度及其活性部分和非活性部分（b）。