摘要：本研究通过使用pH微电极，量化了电力生产生物膜及其浓度边界层内的空间pH分布，以及批量溶液中的pH分布。探讨了pH分布与电流密度之间的关系。发现：（1）与批量溶液的pH 6.90相比，Geobacter生物膜内的阳极表面附近的pH水平低至5.57；（2）生物膜内的平均pH水平随时间减小；（3）生物膜内的pH变化改变了循环伏安法的中点电位，每单位pH下降59.0 mV；（4）对于25 mM磷酸盐缓冲溶液，阳极表面附近的pH水平低至4.91，而对于100 mM磷酸盐缓冲溶液，则为5.73。此外，还提出了一种通过绘制pH-深度剖面的导数来估算生物膜厚度的方法。

1引言

电力生产生物膜以一种独特的方式进行呼吸，利用固体外部材料作为其新陈代谢的终端电子受体，这在生物电化学系统（BESs）中作为催化剂具有兴趣，例如微生物燃料电池（MFCs）和微生物电解电池（MECs），以及海水淡化、生物修复和传感系统[1-4]。阳极呼吸细菌（ARB）利用MFCs、MECs或其他生物电化学系统的阳极进行呼吸，最终将电子从微生物转移到阳极。阳极生物膜的电流是由氧化反应引起的，其中发生氧化反应，底物如乙酸或其他有机物质被消耗。在这个过程中，质子释放到阳极液中，电子转移到阳极[5,6]，如式（1）所示。

（1）

电子转移必须伴随质子转移以保持溶液电中性，这预计会导致生物电流外部和内部产生pH梯度。此外，更高的电流产生可能会导致更大的质子积累，而这反而可能对阳极生物膜的生长和电子产生产生抑制作用[7-9]。众所周知，pH在确定电力生产生物膜性能方面起着关键作用，因此，了解生物膜内的pH分布对于理解BESs中的电子产生和传输机制非常重要。

大多数关于pH变化对阳极生物膜影响的研究局限于批量溶液。研究表明，随着缓冲液浓度的增加，电流密度增加，表明电流密度受生物膜外质子传输的限制[5]。Franks等人证明，当将批量pH从6.9改变为6.15时，使用Geobacter sulfurreducens作为阳极生物膜时，电流减少了50%[10]。为了更好地理解质子传输机制，还建立了数学模型来预测电化学活性生物膜（EABs）中的质子传输。预测了100mm厚阳极生物膜中的pH变化为0.03单位[11]。Marcus等人预测，对于15 A m2，450mm阳极生物膜上的pH变化为1.5单位[7,8]。通过引入pH敏感荧光探针测量了Geobacter生物膜内4个不同深度的pH值。发现阳极表面附近的pH水平为6.1，而外部介质中为7[10]。Babauta等人使用微电极测量了在1.05 mA电流下Geobacter生物膜内的pH从6.8下降到6.5，在1.85 mA电流下从6.9下降到6.3[12]。这些研究证明了电力生产生物膜内pH分布的重要性。因此，目前仍不清楚电流密度和阳极生物膜内pH分布如何相互关联。细胞产生的质子及其从阳极生物膜中传输出来，应导致生物膜内形成质子梯度。跨越生物膜深度的pH梯度的形成会导致内部微生物的性能降低，并影响其生长[13]。因此，理解微尺度生物膜内pH分布的详细特性及其对电力生产性能的影响对于改善更好性能的阳极至关重要。

本研究的目标是量化电力生产生物膜深度的空间和时间pH分布和变化。还探讨了pH分布与电流密度之间的关系。Geobacter spp是电力生产细菌的优秀候选者，因为它可以将乙酸转化为电子，并且电子转移被认为是直接的[3,11,12,14]。通过pH微电极获取了Geobacter生物膜内的pH-深度剖面，这种方法允许在活体生物膜中进行非侵入性、无破坏性、高空间分辨率和实时测量。找到上述条件取决于了解阳极生物膜内微观尺度条件，这在目前作者所知之前尚未报告过。此外，还建议通过绘制pH-深度剖面的导数来估算生物膜和边界层的厚度。

2材料和方法

2.1生物反应器

电力生产生物膜在一个三电极生物反应器（300 mL）中生长在工作电极上，在恒定的施加电位下（相对于Ag/AgCl为0.1 V）。碳布（0.36 0.02 mm厚）的投影表面积为2.4cm2（2.0 cm 1.2 cm），过大的Pt网格（2.0 cm 2.0 cm）作为工作和对电极，参考电极为Ag/AgCl（3 M KCl，Leici Instruments，上海，中国）。碳布购自上海贺森电器有限公司，Pt网格购自天津爱达恒升科技有限公司。该反应器的接种物来自一台连续运行了6个月以上，具有Geobacter富集细菌群落（65%）的乙酸喂养MFC，最初来自北京高碑店污水处理厂。在初次接种时，生长介质流动停止了24小时，以鼓励细菌附着到工作电极上。此后，含有乙酸的厌氧、氮气充气的培养基通过具有5小时水力停留时间的反应器循环。乙酸被用作电子供体，工作电极被用作电子受体。所有实验均在35 0.5°C的恒温箱中进行。生长培养基包含CH3COONa（1.64 g L1），NaCl（0.1 g L1），NH4Cl（0.5 g L1），MgSO4 7H2O（0.1 g L1），CaCl2 2H2O（0.02 g L1），每升10 mL Wolfe维生素溶液[12]和50 mM磷酸盐缓冲液。每次进行pH和CV测量后，将反应器中的培养基倒出，以去除生物反应器内壁上的悬浮细菌堆积物。然后再次循环新鲜的生长培养基。此外，还进行了一组重复实验。

2.2 pH微电极的校准

使用pH微电极（Unisense，丹麦）对阳极生物膜内的pH分布进行表征。微电极尖端直径为50微米。在每次测量之前，使用商业缓冲溶液（pH=4.01、6.86和9.18）对pH微电极进行校准。获得了线性校准曲线，斜率在-58.10至-58.80 mV/pH范围内。每次测量后也进行了后校准。

2.3 pH微电极测量

在操作条件下进行了pH测量。通过移除生物膜阳极上方的橡胶塞打开孔口，插入微电极及其参比电极。纯氮气持续从孔口进入顶空，以最小化氧气从开口处进入系统。将pH微电极尖端首先放入距离生物膜表面数千微米的溶液中，然后逐步向下移动（步长为50-200微米在生物膜外部和25微米在生物膜内部），由计算机上的SensorTrace Profiling软件进行定期控制，并同时记录pH值。当通过批量溶液、浓度边界层并最终到达生物膜底部（阳极表面）时进行记录。