结果:

1.脓毒症小鼠肺组织中的ERS升高

图2：脓毒症小鼠肺部内质网应激相关蛋白的表达。在小鼠接受中电手术前、手术后2h、8h、12h和24h采集肺组织。用Western印迹法检测总PERK（A）和eIF2α（A）、p-PERK（A和B）和p-eIF2α（A和C）以及IRE1α（A和D）。

ER应激信号与败血症密切相关。PERK/eIF2α和肌醇需要酶α（IRE1α）是ER应激的两个主要标志物。为了观察脓毒症时ER压力的变化，我们检测了脓毒症后不同时期PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的总表达量。脓毒症诱导了CLP术后2h至24h肺内PERK和eIF2α蛋白的磷酸化（图2），而PERK和eIF2α的总蛋白水平无显著差异（图2）。此外，败血症刺激了ER相关蛋白IRE1α在2小时至24小时内的表达（图2）。p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α的表达峰值出现在CLP后12h，12h与其他时间点相比有显著差异（图2）。这些结果表明，脓毒症通过PERK和eIF2α蛋白的磷酸化诱导ER应激，IRE1α的增加具有时间依赖性。

2.TM和4-PBA对败血症小鼠肺组织中ERS相关蛋白的影响

图3：4-苯基丁酸（PBA）和TM对败血症小鼠肺内质网应激途径的影响。在CLP前给小鼠腹腔注射4-苯基丁酸（40毫克/千克），CLP12小时后收集肺部样本。通过Western印迹检测总PERK（A）和eIF2α（A）、p-PERK（A和B）和peIF2α（A和C）、CHOP（A和G）、ATF（A和F）、IRE1α（A和D）和XBP1（A和E）蛋白的表达。

为了进一步探讨ERS在败血症中的影响，研究人员使用ERS的抑制剂和诱导剂4-PBA和曲卡霉素（TM）来治疗CLP或假手术后的小鼠。结果显示，CLP诱导了脓毒症小鼠肺组织中PERK和eIF2α的磷酸化，并增加了CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表达（图3）。重要的是，与CLP组相比，给药4-PBA能显著减少ERS的发生，与CLP组相比，CLP术后PERK和eIF2α的磷酸化以及CHOP、ATF4、IRE1α和XBP1的表达均受到抑制（图3）。相反，与CLP组相比，TM对ERS相关蛋白有增强作用（图3）。这些结果表明，4-PBA和TM分别抑制和增强了败血症中ERS的激活。

3.ERS调节脓毒症小鼠重要器官和组织的自噬活性

图4：4-PBA和TM对脓毒症小鼠自噬相关蛋白和重要器官的影响。CLP前腹腔注射4-PBA和TM，CLP12小时后收集肺、肝和肾样本。通过Western印迹检测败血症小鼠肺（A和D）、肝（B和E）和肾（C和F）组织中LC3、Beclin1、PINK1和Parkin的表达。给小鼠实施中电手术和注射4-PBA和TM后，用透射电子显微镜观察自噬体（G）。黄色箭头表示双膜自噬体或自溶体。

之前的研究结果表明，败血症会刺激ERS和自噬的发生和发展。在此，为了研究ERS对脓毒症小鼠肺、肝和肾组织中自噬途径活性的影响，小鼠在CLP手术前接受了4-PBA和TM治疗。从数据中，我们发现CLP引发了肺、肝和肾组织中自噬蛋白LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin增加（图4A、B、C、D、E和F）。TM，ERS诱导剂抑制LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin与CLP组的比较（图4），而ERS抑制剂4-PBA逆转了TM对化脓症中LC3II、Beclin1、PINK1和Parkin的表达增加小鼠（图4A，B，C，D，E和F）。与这些结果一致，我们还利用TEM观察了双膜自噬体的形成和自噬体空泡的数量。中电诱导的败血症诱导了自噬活性并增加了自噬体的数量（图G和H）。与CLP组相比，当4-PBA进一步增加自噬体数量时，TM抑制了CLP操作诱导的自噬体数量（图4G和H）。基于这些发现，ERS增加了败血症诱导的自噬活性。

4.缺失ERS可减轻败血症小鼠肺、肝和肾的组织损伤和功能障碍

图5：4-PBA和TM对败血症小鼠重要器官病理损伤的影响。给小鼠腹腔注射4-PBA和TM后，在CLP12小时后收集肺、肝和肾样本。通过苏木精和伊红（H&E）染色检测肺、肝和肾的病理变化（A，放大100倍）。计算损伤评分水平（B、C和D）。

图6：4-PBA和TM对败血症小鼠重要器官功能的影响。给小鼠腹腔注射4-PBA和TM后再进行CLP。术后12小时检测肺MPO活性（A）、BLA总蛋白（B）、肺W/D（C）、ALT（D）、AST（E）、Cr（F）和BUN（G）。分析小鼠的存活率（CLP手术前、手术后1d、2d、3d、5d和7d）（H）。

与我们之前的研究一致，脓毒症诱导肺、肝、肾组织学损伤并导致器官功能障碍（图5和图6）。有趣的是，当对脓毒症小鼠给予4-PBA时，与CLP组相比，败血小鼠的组织病理学改变，如水肿、出血、组织炎症细胞浸润、肝细胞变性或气球变性、肝细胞局灶性坏死、肾小球肿胀和肾小球炎症细胞等，减弱，组织学损伤评分降低（图5A，B、C和D）。此外，与CLP组相比，CLP+4-PBA组败血症引起的BLA总蛋白、MPO活性、肺W/D、血清AST和ALT（肝功能异常的标志物）、血清Cr和BUN（肾功能的常规指标）的增加在4-PBA治疗后有所缓解（图6A、B、C、D、E、F和G）。然而，TM治疗逆转了4-PBA对败血症组织病理学改变和器官功能障碍的保护作用（图6A、B、C、D、E、F和G）。

随后，我们检测了ERS抑制剂是否能提高败血症小鼠的存活率。与CLP组相比，给予4PBA能显著提高脓毒症小鼠的存活率，而在CLP+TM组，TM会降低小鼠的存活率（图5H）。