材料与方法：

动物、败血症模型和实验程序：

所有研究均使用8-10周龄雄性C57BL/6小鼠。小鼠在特定的无病原体条件下饲养，水和饲料自由供应。在全身麻醉的情况下，进行1至2厘米的中线开腹手术以暴露盲肠。然后在回盲瓣远端结扎盲肠，并用18号针头穿刺。盲肠内容物从穿刺的盲肠中挤出，然后将穿刺的盲肠放回腹腔。腹壁切口分层缝合后，注入1mL预热生理盐水进行液体复苏。假小鼠的处理方式与中毒性腹腔注射操作程序相同，但不进行肠道结扎和穿刺。这项工作已按照ARRIVE准则进行了报告。

实验程序：

实验1：小鼠接受假手术或CLP手术，以建立败血症模型。在小鼠接受手术前、手术后2小时、8小时、12小时和24小时采集肺组织。用Western印迹法检测总PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α以及IRE1α。

实验2：小鼠随机分为四组：Con组、CLP组、CLP+TM组和CLP+4-PBA组。手术前1小时分别腹腔注射2mg/kg或40mg/kgBW的TM和4-PBA。术后12h检测血清中的肺MPO活性、BLA总蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。术后12h采集肺、肝和肾组织。取部分肺组织，用Western印迹法检测总PERK和eIF2α、p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1蛋白。用部分肺、肝和肾组织进行Western印迹检测LC3、Beclin1、PINK1和Parkin。用部分肝脏组织通过TEM检测自噬体或自溶体。部分肺、肝和肾组织通过H&E染色进行器官损伤评分。分析小鼠术前、术后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

实验3：小鼠随机分为四组：Con组、CLP组、CLP+3-MA组和CLP+Rap组。手术前1小时分别腹腔注射雷帕霉素或3-MA，剂量为10毫克/千克或15毫克/千克体重。收集肺、肝和肾组织，在手术后12小时用Western印迹法检测p-PERK和p-eIF2α、CHOP、ATF6、IRE1α和XBP1。

实验4：小鼠随机分为五组：Con组、CLP组、CLP+H2组、CLP+H2+3-MA组和CLP+H2+TM组。在假手术和CLP手术后1小时和6小时腹腔注射富含H2-的生理盐水（5mL/kg）。TM和3-MA处理同实验2和3。术后12h检测血清中的肺MPO活性、BLA总蛋白、肺W/D、ALT、AST、Cr和BUN。采集部分肺组织，用Western印迹法检测NF-κb，用ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL1β、IL-6和HMGB1的表达。部分肺、肝和肾组织经H&E染色进行器官损伤评分。分析小鼠术前、术后1d、2d、3d、5d和7d的存活率。

详细的实验方案见图1。

富氢盐水（HRS）的生产和管理：

根据我们之前的方法，使用氢气产生装置在高压（0.4兆帕）下将氢气溶解在0.9%的NaCl中4小时，使其达到过饱和状态。饱和富含H2的生理盐水保存在无死体积的铝袋中，在4°C常压下储存，并用γ辐射灭菌。按照Hayashida等人发表的方法，使用针式氢气电极（UnisenseA/S，丹麦奥胡斯）检测生理盐水中的H2浓度。富含H2的生理盐水每周新鲜配制一次，以确保浓度为0.6mmol/L。

器官组织病理学检查：

实验结束后，收集肺、肝和肾组织以检测器官形态的变化。获得的组织在10%缓冲福尔马林中固定至少48小时，用石蜡包埋，并用苏木精和伊红染色观察。使用ImageJ和Microsuite显微镜对切片进行评估。肺脏、肝脏和肾脏的组织学改变由病理学家进行盲法评估。器官的评分标准与我们之前发表的文章相同。

肺髓过氧化物酶（MPO）活性测定：

实验结束后，采集肺组织以检测MPO活性。对组织进行灌注、匀浆和离心，收集的上清液使用商业试剂盒通过分光光度计在590纳米波长下按照制造商的说明进行测量。

肺W/D重量比：

实验结束后，切除肺组织，剁碎，快速吸干，并按湿重称重。然后将样本放入60°C的烘箱中烘烤24小时，再次称量干重。使用W/D重量比检测肺水肿。

BAL总蛋白测定：

实验结束后，结扎一侧肺，用20mL/kg冷无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.2-7.4）冲洗另一侧肺三次。洗液在4°C下以1000×g离心10分钟。制备上清液，使用商业试剂盒和微孔板阅读器在450/540纳米波长下检测总蛋白。

肝功能和肾功能检测：

小鼠的肝功能（丙氨酸氨基转移酶[ALT]和天门冬氨酸氨基转移酶[AST]）和肾功能（血尿素氮[BUN]和血清肌酐[Cr]）是使用商业ELISA试剂盒和自动临床化学分析仪按照制造商的说明进行测定的。

存活率：

术后第1、2、3、5和7天，在每天的同一时间点记录小鼠的存活或死亡情况。

ELISA检测：

采用ELISA法检测血浆中的细胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的检测采用特定的ELISA试剂盒，微孔板阅读器按照制造商的说明进行。

透射电子显微镜观察：

采集肝脏组织，切成1立方厘米的小块，浸泡在固定液（2.5%戊二醛）中过夜。清洗后，将组织固定在10%的缓冲戊二醛和1%的渗透酸中，脱水后嵌入Epon812中。之后，切片并在透射电子显微镜下观察。通过计算每个细胞中自噬体的数量对结果进行量化。

Western印迹分析：

实验结束后收集肺、肝和肾组织。样本在冰上匀浆，4℃下15,000×g离心30分钟，然后用RIPA裂解液裂解。用双喹啉酸测定法测定所有样本的蛋白质浓度。等量蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素上。在37°C下用阻断缓冲液（5%脱脂奶）阻断1小时后，用以下一抗孵育薄膜：洗膜后，用辣根过氧化物酶结合的第二抗体进行孵育，37℃下1.5小时。膜洗净后用增强化学发光试剂显影。用QuantityOne系统软件分析印迹灰度值。以β-肌动蛋白或组蛋白作为蛋白质样品的负载对照，目标印迹与参考条带的灰度比值被视为蛋白质的相对表达水平。

统计分析：

存活率采用费雪精确检验概率法进行分析。所有研究数据均以平均值±SEM表示。使用GraphPadPrism对多组数据进行单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较检验。当P值小于0.05时，认为组间存在统计学意义。