材料与方法

菌株和种子培养物制备

本研究中使用的Penicillium decumbens JUA10由山东大学微生物技术国家重点实验室(SKLMT)惠赠。将其保存在小麦麸皮汁斜面培养基中，该培养基包含1%(w/w)葡萄糖、10%(w/w)麸皮提取物和2%(w/w)琼脂，于4°C保存。

Penicillium decumbens JUA10在100 mL液体培养基（包含1%(w/w)葡萄糖和10%(w/w)麸皮提取物）中，于30°C和180 rpm下预培养36小时，然后接种。

固态发酵条件

稻草生物质在4.5 L蒸汽爆破反应器（威海自控有限公司，中国威海）中，于1.5 MPa压力下蒸汽爆破5分钟。预处理后，将蒸汽爆破稻草(SERS)手动切碎，平均颗粒长度分别为4.0 cm、1.5 cm和0.4 cm。

固态培养基由蒸汽爆破稻草/麸皮(8.0 g/2.0 g)(w/w)和8.0 mL的1.5%(NH_4)_2SO_4、0.6%MgSO_4和0.3%KH_2PO_4无机盐溶液组成。通过添加蒸馏水，将固态培养基的初始水分含量调整为65%、75%和85%。

在固态发酵接种前，固态底物在121°C灭菌30分钟。灭菌后，固态底物在室温下冷却，并通过每克干底物添加0.5 mL种子液进行接种。固态发酵在300 mL柱状瓶中进行，采用不同的水分含量(MC)和颗粒长度，在30°C的摇床水浴中培养120小时。每24小时取样发酵液并进行分析。

底物形态结构测定

在柱状瓶中，每24小时使用高分辨率相机（35毫米佳能PowerShot A650，50毫米镜头）检查发酵底物底部和顶面的形态结构。^14每个样品获取20张数字图像，并以JPEG格式存储用于分析。使用120位、3264x2448像素矩阵进行图像抓取。图像分析方案包括使用数字图像处理方法改进图片，并使用MatLab 7.1计算分形维数。拍照和数字图像处理的详细步骤在之前的研究中有描述。^14

Penicillium decumbens JUA10生物量的测定

生物量通过葡糖胺法测定。^15，16首先，每12小时对发酵底物取样，在80°C干燥箱中干燥，并用研钵手动粉碎。将0.5克处理过的样品溶解在10 mL 12 mol L^{-1}盐酸中24小时，然后加入40 mL去离子水。将混合物在121°C加热2小时。最后，将混合物过滤，滤液溶解至50 mL，取10 mL此液体用NaOH中和，然后用去离子水溶解至25 mL。

将1.0 mL乙酰丙酮溶液（由乙酰丙酮与0.5 mol L^{-1}Na_2CO_3按1:50(v/v)比例组成）加入1.0 mL葡糖胺提取液中，混合物在90°C下保持1.0小时。室温冷却后，加入6.0 mL乙醇和1.0 mL Ehrlich溶液，并在65°C下保持10分钟。在530 nm处通过比色法测定样品。

Ehrlich试剂是通过将2.67%(w/w)4-(二甲氨基)-苯甲酸乙酯溶解在乙醇和浓盐酸（按体积比1:1混合）的混合液体中配制而成，用于1.0 L。

底物渗透率的表征

底物渗透率每24小时使用内部实验室设备（专利申请号201110204349.3）测定，重复三次。底物渗透率实验在30°C下进行。

底物中氧气分布的测定

由于微电极具有高空间精度和测量精度，使用微电极测定氧气浓度。与普通的毫米级电极相比，它具有独特的电化学特性，可以测量微环境的物理化学参数，并且不破坏测量点的生态环境。测量装置微电极购自丹麦Unisense。测量系统由皮安表、连接到步进器的电机驱动微操纵器以及控制和软件分析组成。将电极垂直刺入发酵底物。电机驱动微操纵器的速度保持在0.2 mm s^{-1}，测量距离为1.5-2.0 cm。每24小时在每组中的两个不同点检查发酵底物中的氧气分布。

结果与讨论

SSF底物的形态变化

我们之前的工作证明，微生物生长引起的底物形态变化可以通过固态发酵的分形动力学模型进行定量表征，并且不同条件下真菌生长引起的底物结构变化也可以通过分形维数来表达。^14为了确定固态底物变化、真菌生物量以及不同水分含量和颗粒长度的菌丝体-基质分形维数之间的关系，在SERS/麸皮培养物上每隔24小时从顶部和底部两侧拍照。还系统地定量表征了真菌生物量与分形维数之间的关系，结果如图1和图2所示。

在生物量转化过程中，固态底物的水分含量(MC)和颗粒长度(PL)是影响生物量转化效率和微生物生长的主要参数，特别是对于固态发酵。^17，18结果表明，对于所有实验，从12小时到72小时的发酵时间内，真菌生物量迅速增加，然后在72小时到120小时的发酵时间内保持恒定值（图1）。最大的生物量约为每克底物0.75克，在85%MC和0.4 cm PL条件下，发酵时间从12到120小时获得（图1）。图1显示，SSF中的真菌生物量在水含量实验中遵循85%>75%>65%的顺序，在颗粒长度实验中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的顺序。结果表明，高水分含量和小颗粒长度有利于真菌生物量的增加，可能是因为它增强了营养物质传递和利用效率。^19

底物形态结构因发酵过程的利用和降解作用而被真菌生长明显改变。^20，21在使用Penicillium decumbens JUA10的SSF过程中，真菌菌丝体与底物交织在一起，形成难以分离的混合物。在先前的研究中，分形维数已被有效地用于评估真菌-底物复合物。图2显示，SSF中的分形维数在水含量实验中遵循65%>75%>85%的顺序，在颗粒长度实验中遵循0.4 cm>1.5 cm>4.0 cm的顺序。结果表明，高水分含量和大颗粒长度提供了最低的分形维数。同时，有趣的是，分形维数在发酵时间从12小时到48小时期间下降，然后在发酵时间从48小时到120小时期间增加。造成这种情况的可能原因是，在真菌生长的早期阶段，由于真菌占据底物内部空间，分形维数降低。然而，随着发酵时间的增加，真菌利用导致固态底物分解成小块，这导致底物的分形维数逐渐增加。同样有趣的是，发酵48小时后不同颗粒长度的分形维数差异小于发酵48小时前的差异（图2(B)）。造成这种情况的可能原因是，大颗粒长度生物质在48小时后被降解成小块。同时，小颗粒长度生物质在发酵过程中容易团聚，然后在固态发酵后期颗粒长度生物质的差异减小，这导致相应的分形维数差异也减小。因此，结果表明，分形维数可以有效地表达底物形态结构的变化，并且也可以在固态发酵中不同水分含量和颗粒长度下表征真菌生物量的相应增长。