近年来，随着微纳制造技术和传感检测技术的快速发展，以及细胞培养技术的日益成熟，基于心肌细胞的无标记、实时、非侵入性细胞检测的生物传感器的研究越来越受到人们的关注。微电极阵列（Microelectrode array，MEA）是一种用于检测细胞电生理活动的设备，它由多个微型电极组成，能够同时记录或刺激多个细胞的电信号。这些电极通常布置在一个基底上，形成阵列，用于研究神经网络、心肌细胞等电生理特性。MEA技术被广泛应用于生物学、医学和生物工程领域，特别是在神经科学研究和心脏病学研究中。

对心肌细胞电生理特性的有效检测，能帮助研究者和临床医生更好的理解低血糖引发的各类心脏疾病的致病机制和病程的发展。然而目前的体外细胞模型并不能实时准确地反映心肌细胞在葡萄糖剥夺条件下的电生理变化，因此亟需开发一种新的实验方法帮助相关科学研究的开展。

摘要:本发明公开了一种长期动态检测心肌细胞能量应激状态的实验方法，包括：搭建基于微电极阵列的生物传感系统、微电极阵列芯片的表面修饰、培养原代心肌细胞、检测心肌细胞能量应激状态：首先将微电极阵列芯片表面包被明胶；然后分离并提取原代心肌细胞，制备原代心肌细胞悬液并种植在微电极阵列芯片培养腔内；最后将心肌细胞培养于不同葡萄糖浓度的培养基中，实时记录心肌细胞胞外局部场电位信号的变化；提取电位信号的时域和频域特征并进行归一化，得到该葡萄糖浓度条件下的浓度依赖响应曲线。本发明利用心肌细胞自发放电的生理特性，结合微电极阵列芯片，实时记录葡萄糖剥夺条件下心肌细胞的电生理变化，实现对细胞能量应激状态的检测评价。

本发明的实验装置：

本发明提供的一种长期动态检测心肌细胞能量应激状态的实验装置，包括细胞电生理传感装置、信号采集器、信号放大器、计算机和细胞培养箱。其中，细胞电生理传感装置为现有公开文献记载的技术，包括中空玻璃培养腔、微电极阵列芯片和印刷电路板（Printed Circuit Board，PCB）适配器；该传感装置的结构和加工方法具体可参考专利申请公开文献CN115078466A。信号采集器通过长屏蔽电缆连接信号放大器，信号放大器由数据连接线与计算机连接。细胞电生理传感装置插入信号采集器后，可放入细胞培养箱中进行长时间的心肌细胞电生理信号采集。

进一步地，将信号采集器与信号放大器分别置于两个独立的金属盒内，以减小体积，由此可将传感装置放置在培养箱内以保持心肌细胞的活力，实现对电生理信号的长时间、连续监测；将另一个金属盒放置于培养箱外部以方便操作。

进一步地，微电极阵列芯片插槽外部加装金属盖，以屏蔽外部信号干扰，提高信噪比。

附图说明

图1是本发明实施例中葡萄糖剥夺前后心肌细胞电生理信号变化图；

图2是本发明实施例中葡萄糖剥夺前后心肌细胞电生理信号特征参数统计图；其中，图2中的（A）为无糖组、葡萄糖组、对照组的细胞幅值与时间关系的曲线图；图2中的（B）为无糖组、葡萄糖组、对照组在连续培养24小时过程中心肌细胞的放电频率与时间关系的曲线图；

图3是本发明实施例中葡萄糖剥夺同时抑制细胞自噬的心肌细胞电生理信号变化图；

图4是本发明实施例中葡萄糖剥夺同时抑制细胞自噬的心肌细胞电生理信号特征参数统计图；其中，图4中的（A）为24小时连续监测细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理葡萄糖饥饿心肌细胞的归一化幅值变化曲线图；图4中的（B）为葡萄糖饥饿条件下3-MA对心肌细胞发放频率的影响曲线图。

一种长期动态检测心肌细胞能量应激状态的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）搭建基于微电极阵列的生物传感系统：将信号采集器、信号放大器和计算机进行连接；所述信号采集器用于采集和记录电生理信号，所述信号放大器用于放大电生理信号；将微电极阵列芯片插入信号采集器，并放入细胞培养箱中；（2）微电极阵列芯片的表面修饰：将微电极阵列芯片表面包被明胶，用于增强心肌细胞在微电极阵列芯片表面的粘附程度；（3）培养原代心肌细胞：分离并提取原代心肌细胞，制备原代心肌细胞悬液，并将原代心肌细胞悬液种植在微电极阵列芯片培养腔内，心肌细胞均匀分布于微电极阵列芯片表面；（4）检测心肌细胞能量应激状态：将心肌细胞培养于不同葡萄糖浓度的培养基中，实时记录微电极阵列芯片上的心肌细胞胞外局部场电位信号的变化；提取所检测到的电位信号的时域和频域特征，并进行归一化处理，得到该葡萄糖浓度条件下的浓度依赖响应曲线，根据曲线体现的电位信号衰减趋势判断不同程度的葡萄糖剥夺所导致的能量应激状态。

本发明的有益效果：本发明利用心肌细胞自发放电的生理特性，结合微电极阵列芯片，通过简单、高效的方法实时快速地记录葡萄糖剥夺条件下心肌细胞的电生理变化，实现对细胞能量应激状态的检测评价，且为理解低血糖对心脏的影响提供了新的工具，对糖尿病和低血糖症的药物筛选和临床研究具有重要价值。