3总结

本研究首次构建了一种新型酸反应抗癌纳米药物AB MSN，利用瘤内酸微环境原位控释H2，降低瘤内过量表达的ROS水平，达到抗癌目的。我们充分利用载体MSN的高比表面积和对原药AB的强氢键吸附，获得了130.6mg/g的超高H2负载能力，是传统H2溶剂脂质体纳米药物的1370倍以上。我们观察到，在四种不同的磷酸盐缓冲溶液(pH=5.0、5.8、6.8、7.4)中，PBS的酸度越高，H2的释放速度越快。在pH=6.8的微酸性PBS(模拟瘤内酸性微环境)中，纳米药物实现了H2的持续释放；而在pH=7.4的PBS(模拟正常环境)中，由于MSN和AB之间的氢键作用使其稳定，纳米药物没有释放H2。纳米药物在细胞内释放的H2能降低癌细胞中过度表达的ROS，从而表现出选择性抗癌的特点。AB MSN纳米药物在体外和体内只对癌细胞造成伤害，而对正常细胞和组织没有任何影响，能有效抑制肿瘤生长，具有很高的生物安全性。

4实验步骤

4.1载体MSN的合成

载体MSN是以十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)为表面活性剂和孔隙形成剂，正硅酸四乙酯(TEOS)为硅源，三乙醇胺(TEA)为水解催化剂和沉淀剂合成的。首先，将CTAC(25wt.%，10mL)和三乙醇胺(TEAH，20%，1.5mL)依次溶解于88.5mL水中，在95℃下充分搅拌。1小时后，滴加7.5mL TEOS，混合物再搅拌1小时。离心收集产物，依次用100mL乙醇(EtOH)、(1mL 37%HCl+100mL EtOH)和EtOH洗涤一次。然后用盐酸乙醇溶液萃取MSN孔中的CTAC三次。最后，将得到的MSN分散到水中。

4.2 AB MSN纳米药物的构建与表征

将66毫克AB完全溶解在200升10毫克/毫升的MSN水溶液中，然后在14,000转/分的转速下离心10分钟，收集AB MSN纳米药物。除去上层清液，将新鲜收集的AB MSN纳米药物用于后续实验。用扫描电镜和电子显微镜测量了MSN的形态和结构。用衰减全反射傅立叶变换红外光谱(ATR-FTIR)检测AB、MSN和AB MSN的分子结构。傅立叶变换红外光谱由Thermo-Nicolet Nexus 670 ATR-IR光谱仪采集。根据傅立叶变换红外光谱，AB MSN纳米药物显示出AB和MSN的特征峰组合。

4.3测量MSN的AB负载能力

通过比较AB和MSN的红外特征透射强度，计算出MSN的AB负载能力。首先，按AB与MSN的不同摩尔比(1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1)制备AB与MSN的混合物，并用AB的摩尔百分比/(AB+MSN)绘制标准曲线。收集了AB和MSN混合物的傅立叶变换红外光谱。记录了它们在2330nm和1088nm处的透射强度(I2330nm，I1088nm)，这分别是AB和MSN的特征峰，互不干扰。I2330nm/I1088nm与AB/(AB+MSN)摩尔百分比的标准曲线进行线性拟合，得到函数y=-0.90757X+1.42648。记录新收集的AB MSN纳米药物的傅立叶变换红外光谱，得到其I2330nm/I1088nm值，并根据上述标准曲线计算MSN的AB负载能力。经计算，MSN的AB负载能力高达每克MSN 653毫克AB。

4.4在不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中测量AB和AB MSN纳米药物的H2释放量

首先，制备四种不同pH值(pH=5.0、5.8、6.8和7.4)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。将收集到的AB MSN纳米药物平均分散到四份100mL不同pH值(pH=5.0、5.8、6.8和7.4)的N2-staurated PBS中，并立即密封反应容器。将氢气微电极(Unisense)立即放入AB MSN的PBS溶液中，以监测H2的释放。

4.5检测AB MSN纳米药物的细胞内H2释放量

用亚甲基蓝(MB)和铂纳米粒子(∼3nm)组成的探针检测AB MSN纳米药物的细胞内H2释放，因为在铂纳米粒子的催化作用下，MB被H2还原时，其蓝色会迅速减弱。664nm处吸光度的降低与H2的量呈线性关系。使用Bio-Tek微孔板阅读器在96孔板中测量MB溶液的标准曲线(图S1)，用于量化MB的还原和H2的释放。探针溶液由浓度分别为300和13.9g/mL的甲基溴和铂纳米粒子混合配制而成。将探针溶液(10升)加入已用100升培养基培养HeLa细胞24小时的96孔板的每个孔中。通过显微镜观察可以发现，由于细胞呈蓝色，MB和铂几乎全部渗入细胞。然后排干溶液，用PBS冲洗一次，在每个孔中加入100g/mL的纳米药物培养基溶液。培养一定时间后，使用Bio-Tek微孔板阅读器追踪664纳米波长处的吸光度(MB吸收峰)。结果发现，随着时间的推移，664纳米波长处的吸光度逐渐下降，直至处理后75分钟。与此同时，我们坚持在几个特定的孔中定性测量细胞内的H2。我们在三个典型的时间点(0分钟、60分钟、90分钟)用显微镜拍摄了几张数码照片。照片显示，随着时间的推移，细胞的颜色逐渐变淡，这表明纳米药物在细胞中持续产生了H2。

4.6检测细胞内ROS水平

使用ROS试剂盒检测细胞内ROS水平。将HeLa细胞(1×104个细胞/孔)种植在96孔板中。培养24h后，用100L含有100g/mLAB MSN的新鲜培养基取代每孔中的培养基，然后按照ROS试剂盒的说明在每孔上方加入10LROS试剂。培养一段时间后，使用Bio-Tek微孔板阅读器(ex:488nm,em:525nm)记录荧光强度。未处理AB MSN纳米药物的细胞孔作为空白对照。样品与对照组在488纳米波长处的荧光强度差被用来表示细胞内ROS水平的变化，反映了释放的H2对ROS的减少作用。

4.7 AB MSN纳米药物的细胞毒性测定

使用CCK-8试剂盒测量细胞毒性。在细胞水平上，我们以HeLa(宫颈癌)、B16-F10(黑色素瘤)和U87(神经母细胞瘤)细胞作为三种肿瘤细胞模型，以HEK-293细胞作为正常细胞模型，测试了游离原药AB、载体MSN、分解产物B(OH)2ONH4和AB MSN纳米药物的细胞毒性。首先，将上述四种细胞以1×104个/孔的密度种植在96孔板中，并用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37◦C和5%CO2的湿度培养箱中培养，直至细胞充满孔面积的90%。用PBS(对照)、浓度为0-100g/mL的MSN、B(OH)2ONH4、AB或AB MSN溶液替换培养基。培养24小时后，在每个孔中加入10升CCK8。培养24小时后，在每个孔中加入10升CCK-8溶液。再培养1小时后，使用Bio-Tek微孔板阅读器读数(吸收波长450nm)。与空白对照相比，细胞毒性以细胞存活率的百分比表示。每个数据以8个独立实验(n=8)的平均值±标准偏差表示。

4.8肿瘤小鼠模型的体内抗肿瘤效果

将3×107个HeLa细胞注入Balb/c雌性裸鼠(16-20克，购自广东省医学实验动物中心)后肢，建立HeLa肿瘤小鼠模型。待肿瘤平均体积达到约100mm3后，将肿瘤小鼠随机分为5组×5只，分别注射AB MSN纳米药物(16.5mg/mL，PBS)、MSN载体(10mg/mL，PBS，MSN浓度相等)、游离药物AB(0.65毫克/毫升，与AB MSN相比为AB浓度的1/10)、分解产物B(OH)2ONH4(16.6毫克/毫升，与AB MSN相比为等量AB浓度)以及作为空白对照的PBS(100升)。在给定的时间点，用游标卡尺测定肿瘤大小，肿瘤体积的计算公式为：1/2×长×宽2。深圳大学动物实验管理委员会批准了所有动物实验方案。

4.9血色素和伊红(H&E)染色组织学检查

在进行H&E染色组织学检查时，所有小鼠均被人道处死，并在治疗三周后收获主要器官(心、肝、脾、肺和肾)，用4%的聚甲醛溶液固定，并用石蜡包埋进行H&E染色。