图3游离AB原药(A)和AB MSN纳米药物(B、C)的酸反应H2释放行为。

在四种不同的磷酸盐缓冲溶液(pH=5.0、5.8、6.8、7.4)中测试了AB释放H2的酸反应分解行为。从图3A可以看出，游离AB在酸性磷酸盐缓冲溶液中很快分解成H2，而且磷酸盐缓冲溶液的酸度越高，H2释放越快。即使在pH=6.8的微酸性环境(模拟瘤内酸性微环境)中，H2的释放速率也高达19.8μM/h，反映了高酸反应性。然而，在pH=7.4的PBS(模拟正常组织环境)中，游离AB没有发生明显的分解。AB MSN纳米药物也具有类似的AB分解和H2释放的酸反应性(图3B)，这使得该纳米药物能够实现瘤内酸性微环境响应性H2释放，从而实现高效氢治疗。此外，值得注意的是，与游离AB相比，MSN中AB的分解/释放速率大大降低。PBS酸度越低，H2释放率的降低幅度越大(图3A和C)。这应该是由于上文提到的MSN与AB之间的氢键吸引力起到了稳定作用。这种分解行为的减轻为持续释放H2(>2天)带来了好处，非常有利于长期氢气治疗。

图4用MB+Pt探针测定三种不同浓度(25、50和100g/mL)的AB MSN纳米药物的细胞内吸收(A)。

使用亚甲基蓝(MB)加胶体铂纳米粒子(Pt)的典型氢探针进一步研究了AB MSN纳米药物的细胞内H2释放情况。首先，图4A中用红色荧光RITC(罗丹明B异硫氰酸酯)染料标记MSN的共聚焦观察结果证实，AB MSN纳米药物在很大程度上可被癌细胞吸收。定性结果如图4C所示，随着培养时间的延长，细胞的蓝色逐渐变淡，这表明在铂的催化作用下，释放的H2还原了MB，从而增加了细胞中H2的释放量。使用微孔板阅读器记录664纳米波长处甲基溴特征吸收峰的吸光度，然后根据绘制的标准曲线转换成H2浓度，进一步收集定量数据(图S3)。如图4B所示，AB MSN纳米药物在细胞内逐渐释放出H2，细胞内H2释放率取决于AB MSN纳米药物的浓度。纳米药物浓度越高，细胞内的H2释放越快。AB MSN纳米药物在细胞内释放H2的现象得到了证实，这为进一步实施氢疗法提供了可能。

图4氢气释放(B-D)：定量数据(B)，以及100g/mL纳米药物细胞内氢气释放时蓝色减少的定性观察(C)。用基于DCFH-DA探针的ROS检测试剂盒检测AB MSN纳米药物诱导的HeLa细胞内ROS减少情况(D)。

酸反应性氢气释放行为表明，所构建的AB MSN纳米药物尤其适用于癌症治疗，因为瘤内微环境通常呈微酸性(pH=6.2-6.8)。Ohta等人发现，施用氢气可选择性地减少细胞毒性活性氧(ROS)，如羟自由基，而羟自由基通常在肿瘤细胞中过度表达。氢气治疗癌症的一个公认机制是细胞内氢气的抗氧化能力。因此，我们研究了AB MSN纳米药物对细胞内ROS水平的影响，以检测其抗癌潜力。我们使用基于DCFH-DA探针的ROS检测试剂盒来检测纳米药物治疗前后HeLa细胞内的ROS水平。从图4D中可以发现，AB MSN纳米药物的使用使HeLa细胞中的细胞内ROS水平显著下降，并且随着纳米药物浓度的增加，细胞内ROS水平的下降幅度越来越大。这应归功于纳米药物在细胞内释放的H2(图4)。这些关于酸反应性H2释放和细胞内ROS降低的积极结果使氢治疗癌症成为可能。

图5游离原药AB、载体MSN、分解产物B(OH)2ONH4和AB MSN纳米药物对HeLa(A)、B16-F10(B)和U87癌细胞(C)以及Hek-293T正常细胞(D)的细胞毒性比较。

使用三种典型的癌症细胞系(HeLa、B16-F10和U87细胞)和一种正常细胞系(Hek-293T细胞)进一步研究了AB MSN纳米药物的体外癌症治疗效果。从图5A-D可以看出，在较宽的浓度范围(0-100g/mL)内，载体MSN和药物分解产物B(OH)2ONH4对所研究的任何细胞都没有明显的细胞毒性，而游离AB原药在相对较高的药物浓度(≥50g/mL)下表现出普遍的细胞毒性，这可能是由于如上所述游离AB在细胞内过快释放H2所致(图3A)。相比之下，相同浓度的AB MSN纳米药物对三种癌细胞的细胞毒性都明显增强(图5A-C)，但对正常细胞的细胞毒性却有所降低(图5D)。纳米药物的这种选择性抗癌特性应源于高效的细胞内药物递送和H2的长期持续释放(图3B)。纳米药物的细胞内药物保护递送避免了AB分解出细胞，从而增加了细胞内的H2含量，提高了氢气治疗的疗效。同时，纳米药物的H2持续释放消除了过快释放对正常细胞的负面影响。此外，外源H2还能发挥调节细胞内氧化还原水平的作用，包括减少癌细胞中高表达的ROS(图4)，从而杀死癌细胞。AB MSN纳米药物具有选择性抗癌特性，这一令人兴奋的发现鼓励我们开展体内癌症治疗实验。

图6使用AB MSN纳米药物对4T1肿瘤小鼠进行治疗的结果：注射PBS对照组、游离原药AB、载体MSN、分解产物B(OH)2ONH4和相同摩尔浓度的AB MSN纳米药物(AB稀释10倍除外)后肿瘤体积的变化(A)，治疗20天后肿瘤重量的比较(B)，小鼠体重随时间的变化(C)，以及小鼠生存能力随时间的变化(D)。

此外，研究人员还利用携带HeLa肿瘤的Balb/c裸鼠模型研究了AB MSN纳米药物的体内癌症治疗效果。小鼠被随机分为五组，即空白对照组(PBS)、三个对照组(MSN、AB、B(OH)2ONH4)和一个治疗组(AB MSN)。从图6A和S4可以看出，注射与AB MSN纳米药物相同摩尔浓度的MSN和B(OH)2ONH4(16.5毫克/毫升，PBS，100升)基本上不能明显抑制肿瘤生长，而相同摩尔浓度的游离AB会导致注射小鼠急性死亡，这与体外实验结果一致。因此，将AB稀释10倍作为AB对照组。尽管AB组显示出抑制肿瘤的效果，但游离AB也会导致小鼠持续死亡(注射后8天完全死亡)，其毒性太强，与体外情况类似(图6D)。相比之下，未稀释的AB MSN组在注射后20天内未造成小鼠死亡(图6D)，这说明基于MSN的纳米药物制剂的保护作用降低了毒性。此外，在20天的治疗过程中，AB MSN组能很好地抑制肿瘤的生长(图6A和S4)。注射20天后，提取治疗小鼠的所有肿瘤进行对比，进一步证实了AB MSN纳米药物的显著治疗效果(图6B)。在整个治疗过程中，不同治疗组小鼠的体重几乎没有变化(图6C)。此外，所有小鼠在治疗20天后均被人道处死，取其主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行H&E染色组织病理学评价，发现所有治疗组均未对主要脏器造成明显损伤(图7)，反映了AB MSN无明显的系统毒性。简而言之，AB MSN纳米药物在体内表现出了与体外实验一致的高效、低毒的肿瘤治疗效果。

图7用PBS对照组、载体MSN、游离原药AB、分解产物B(OH)2ONH4，以及相同浓度的AB MSN纳米药物(AB稀释10倍除外)治疗20天后，主要器官(心、肝、脾、肺和肾)的HE染色结果。