在开始实验之前，我们检查了充氧循环是否会引起细胞水平的测量温度或拉伸发生变化。

内皮伤口愈合试验。在进行细胞培养实验前，按照之前的报道对培养孔进行紫外线灭菌，并在膜表面涂上0.1mg/ml胶原I。然后在培养室的每个孔中加入在1毫升完全生长培养基中含有约110,000个HAEC的悬浮液。每孔中播种的细胞来自T-25烧瓶中生长的HAEC亚培养物的胰蛋白酶化。细胞播种后，在20%氧气、5%二氧化碳和37℃的湿润细胞培养箱中培养，直到细胞达到汇合(16小时)。然后，用无菌的200μl移液管吸头划伤内皮细胞单层，并用1×PBS冲洗去除细胞碎片。随后，弃去PBS，取而代之的是完全生长培养基。最后，将培养装置置于带温度控制(37℃)的培养箱中，并连接到气体搅拌器，使细胞暴露于恒定(1%、4%、13%或20%O2)或不同频率(0.6、6或60个周期/小时)和量程范围(13-4%O2或20-1%O2)的氧气浓度循环变化中24小时(所有情况下二氧化碳浓度均保持在5%)。对于任何给定的条件，都包括一个平行对照组(持续13%的氧气，5%的二氧化碳)，以进一步规范伤口愈合率。每个实验组的伤口愈合测量在六个不同的日子里重复进行(n=6/实验组)。

为评估内皮伤口愈合过程，在划伤后(0小时)和实验结束后(24小时)立即测量伤口面积。为此，将培养系统放置在配有电荷耦合器件相机(C9100)的倒置显微镜的电动平台上，使用10倍物镜记录每个孔的相位对比图像。鉴于宏观内皮伤口大于单个图像区域的面积，因此通过NIS软件v4.10.00中相应工具自动获取的九个相邻区域的复合生成来获得完整的伤口图像。使用ImageJ软件(http://imagej.nih.gov/ij/)测量，通过比较每个内皮伤口的初始面积和最终面积来评估伤口闭合情况。简而言之，由一名不知道治疗组的研究人员使用自由选择工具在所有图像中标记伤口边缘。测量每个样本在两个不同时间点的伤口面积，并计算伤口闭合的百分比变化。对于每种实验条件，通过将面积变化百分比与连续暴露于13%O2的细胞对应的面积变化百分比进行归一化，计算出伤口闭合指数。

结果

图2内皮伤口愈合试验。相位对比图像示例，显示实验开始时(t=0小时)和细胞培养24小时后，在持续暴露于13%O2氧气(上图)和4%O2氧气(下图)条件下的细胞单层伤口。黄线和红线分别表示初始和最终伤口边界。在这个具有代表性的例子中，氧气浓度为13%时，伤口闭合面积减少了20.5%，氧气浓度为4%时，伤口闭合面积减少了44.7%。比例尺为500μm。

图2举例说明了培养物暴露于13%O2和4%O2时的内皮伤口愈合过程，显示24小时后，细胞单层修复在缺氧条件下得到加强。内皮单层最初形成的伤口宽度重复性很强：总体为1.033±0.016mm(平均值SE)，比较不同实验组(间歇缺氧的频率和幅度)，未观察到初始伤口宽度的显著差异。

图3恒定氧气浓度下的内皮伤口闭合指数。与作为对照的13%氧气相比，细胞暴露于4%氧气时伤口愈合率明显增加。

图3显示了恒定氧合水平下的分组结果。虽然内皮修复在20%O2和13%O2浓度下总体相似，但在4%O2浓度下，内皮修复出现了相当大的增长(约两倍)。然而，虽然在1%氧气浓度下观察到了类似的伤口闭合反应(与13%氧气浓度相比，有增加38%的趋势)，但它显著低于4%氧气浓度(26%)(P=0.036；n=6/实验组)。

图4间歇性缺氧(IH)下的内皮伤口闭合指数。间歇缺氧的频率和振幅范围都会引起伤口愈合的显著变化。低频IH(0.6次/小时)加速了4-13%幅值范围内的内皮伤口愈合，而模拟严重OSA的高频IH模式(60次/小时)并没有明显改变伤口闭合，与氧气水平无关。数据归一化为连续13%氧气条件下的数据。

内皮伤口闭合显示出很大的差异，这取决于IH挑战的幅度和频率(图4)。与参考值(恒定13%氧气)相比，以0.6次/小时的最低频率使用13%-4%氧气波动的循环可使内皮伤口愈合加快102%(P=0.009)。图4还显示，当IH采用20-1%的周期性氧合摆动时，与13-4%的摆动相比，伤口闭合率有所降低。更具体地说，在6个周期/小时和0.6个周期/小时时，伤口闭合率分别降低了74%(P<0.001)和44%(P=0.029)。模拟严重OSA的高频IH模式的事件发生率(60次/小时)并未显著改变内皮伤口的闭合，无论氧合摆动幅度如何(即20-1%或13-4%O2)。

讨论

这项研究提供了初步证据，证明细胞培养模型中的主动脉内皮伤口愈合受到用于模拟OSA的特定IH范例的很大影响。值得注意的是，研究结果表明，氧压振荡的频率和范围在细胞对损伤的集体反应中起着重要作用。

IH对细胞的影响已通过多种缺氧/复氧模式进行了评估，同时采用了改变培养物上方气室中氧气浓度的传统方法。然而，由于氧气在液体培养基中的扩散速度较慢，这种方法只能可靠地应用非常低的循环速率(通常为几分钟到几小时)，这与OSA患者典型的缺氧/复氧事件频率明显不同。此外，在细胞培养的常规IH环境中实施与OSA相关的循环速率会导致细胞PO2水平与细胞培养系统空气空间中的PO2水平大相径庭，从而提供误导性的研究结果和结论。因此，除了作者实际控制或测量细胞水平氧合的少量研究外，迄今为止还没有广泛研究过OSA相关频率下IH对细胞的影响。最近设计的一种实验方法可以精确控制定义IH曲线的细胞氧合参数(图1)，它使我们能够证实一个假设，即内皮伤口愈合实验中的细胞反应明显依赖于IH特性。此外，我们还探索了各种模拟严重(60次/小时)和轻度(6次/小时)OSA的IH频率，以及与之前一些报告中采用的IH频率类似的非常慢的频率(0.6次/小时)。如此低的IH循环频率事实上并不是在模拟OSA，而是在模拟氧合变化，如肿瘤内发生的氧合变化。另一方面，我们研究了不同的缺氧/复氧振幅范围：一个是文献中常用的范围(20-1%O2)，另一个是与严重OSA时主动脉内皮细胞体内氧摆动条件相吻合的范围(13-4%O2)。

在不同恒定氧合水平下获得的内皮伤口愈合反应(图3)表明，与正常氧合水平(13%O2)相比，在OSA(4%O2)的实际但非常严重的缺氧值下，内皮修复显著增强。然而，值得注意的是，在1%O2的缺氧水平下，伤口愈合明显低于4%O2的水平，而这一水平是一些IH研究中通常假设的，但即使在严重OSA中，对于大动脉内皮来说也是不现实的。因此，我们的研究结果表明，内皮伤口愈合的细胞反应与测试反应的缺氧严重程度并不成正比。因此，我们的研究结果可以作为一个说明性例子，反对缺氧程度越深，细胞反应越强的简单概念。这些来自持续缺氧的数据还指出了在与每种细胞类型和体内龛位的微环境相类似的氧饱和度值下测试细胞的重要性。考虑到生理正常氧合水平明显取决于相关组织，从骨髓的1%到肺泡上皮细胞和动脉内皮细胞的13%不等，这一点尤为重要。因此，传统实验假设大气中的氧气浓度为20%O2相当于细胞的常氧状态显然是有问题的，因为对于几乎所有培养细胞来说，从生理角度来看，这种氧合水平显然是高氧的。具体到内皮细胞，值得注意的是，13%的氧气水平对动脉内皮来说是合理的常氧水平，但对通常处于40mmHg氧压(~5%)的静脉内皮来说却是生理性高氧水平，而且这种水平实际上相当于OSA中动脉内皮所经历的最严重缺氧。在这方面，值得注意的是，在间歇性缺氧的动物中，对于周期性动脉氧饱和度降低的幅度，细胞微环境中的局部分压水平因组织/器官(如脑、肝、肌肉、脂肪和睾丸)的不同而有很大差异。

本研究最重要的发现是伤口愈合率在很大程度上取决于IH模式(图4)。当细胞处于OSA(13%-4%O2)下主动脉内皮细胞的实际氧合波动时，极低(0.6次/小时)的修复率是正常氧合水平(13%O2)的两倍。有趣的是，当循环速率接近重度OSA(60次/小时)时，伤口愈合与常氧对照相似，这表明快速缺氧循环并不一定意味着更高的细胞反应。值得注意的是，当缺氧摆动幅度(20%-1%O2)比OSA中这种特殊细胞类型的实际摆动幅度(13%-4%O2)更大时，内皮细胞的恢复往往会减弱，尤其是在0.6和6个周期/小时的频率下。综上所述，这些发现并不支持IH波动越剧烈，细胞反应越强的观点。为此，图4提供了一个视角，说明内皮伤口愈合的进展如何因IH范例而异(伤口闭合指数大约在四倍范围内变化)。换句话说，由于IH的这些频率和振幅范围涵盖了以前在OSA文献中使用的一些实验条件，如果不注意特定的周期性缺氧条件，可能会得出相互矛盾的结论：IH可能对内皮修复有益、有害或没有任何影响(图4)。因此，通过微调IH实验条件获得的结果强烈表明，至少在OSA领域的体外研究中，需要精确划分细胞所经历的IH的确切模式，IH模式的选择应尽可能模拟每种细胞类型在体内所经历的病理生理氧合条件。

在对OSA中的细胞反应提出的许多具体相关问题中，我们选择了主动脉内皮伤口愈合范例作为例子，而不是试图阐明与任何特定OSA相关的发病机制，主要目的是确定细胞反应对IH范例的依赖程度。心血管改变是增加OSA患者发病率和死亡率的最重要后果之一。特别是，实验和临床研究都清楚地表明，内皮细胞会受到IH的影响，但肥胖、年龄和同源性反应等其他因素也会发挥作用。在这种情况下，要保持正常的内皮结构和功能，就需要修复机制能够正常运行并对损伤做出适当反应。我们在体外研究中获得的结果表明，就修复过程而言，IH和持续低氧似乎都能在全球范围内发挥保护作用(但有很大程度的可变性)，伤口愈合的整体增加就是证明。至于内皮伤口愈合的基本机制如何受到周期性缺氧/复氧的频率和程度的影响，还需要等待进一步的研究，这显然超出了本研究的范围。

尽管如此，我们仍有必要简要回顾并从概念上讨论不同的反应是如何根据具体的缺氧模式而发生的。内皮伤口愈合与其他多种细胞生理反应类似，是一个机制非常复杂的过程，尤其是在随时间变化的微环境条件下。简单地说，细胞单层修复涉及两个主要的一般细胞过程(迁移和增殖)。体内内皮伤口愈合的数据表明，细胞迁移先于细胞增殖，在本研究实验的时间范围内(24小时)，伤口愈合主要是由细胞迁移引起的。然而，细胞迁移和增殖都是由多个分子级联的上调/下调驱动的，而每个细胞内的氧合时间过程会进一步影响这些分子级联。就心血管系统的具体情况而言，据报道，上游和下游生物标志物都会受到IH的调节，而且在某些情况下会受到与持续缺氧不同的调节。低氧诱导因子(HIF)1和2以及NF-B都会通过调节氧化应激和炎症途径以及内皮细胞的细胞凋亡对IH做出反应。此外，IH还会引起促炎细胞因子和脂肪因子的基因表达和分泌发生变化，影响一氧化氮偶联、内皮素-1和内皮素受体，并增加血管内皮生长因子的循环水平。在IH的这种情况下，每个细胞对时变环境的反应可能涉及慢反应和快反应机制，它们分别主要由整个周期的平均缺氧程度以及缺氧循环的速率和幅度驱动。事实上，有研究表明，在一些细胞中，上游反应因子(如HIF-1和HIF-2)可分别对恒定缺氧或循环缺氧做出选择性反应。此外，再氧合的持续时间会调节小鼠氧化应激的诱导。因此，随着循环频率的增加，慢反应机制的相对重要性会降低，而快反应机制则会产生相反的效果。还应考虑到，除循环频率外，细胞氧分压的最大值和最小值也可能调节细胞反应的程度，这可能解释了为什么频率的增加会因缺氧/再氧的摆动范围不同而产生不同的效果(图4)。在主动脉内皮细胞的特殊情况下，我们发现除了最高的IH频率(60次/小时)外(缺氧时间可能不足以发生转录变化)，伤口愈合只对这些细胞在体内经历的范围内的氧合机制有反应。具体来说，从13%的生理值到严重病理情况下动脉血水平的合理预期值(低至4%)。有趣的是，这种增强内皮修复的"甜蜜点"对于连续性和IH都是存在的。

然而，除了IH在单个细胞中引发的反应外，多细胞的综合集体反应也在伤口愈合中发挥作用。最近的研究发现，在参与炎症反应的重要上游因子(如NF-B)中，动态刺激(振荡输入和生物噪声)可在很大程度上调节全球综合细胞反应。此外，最近也有报道称，由于涉及细胞间的交流，驱动细胞集体迁移(如伤口愈合的基础机制)的机制与驱动孤立细胞迁移的机制并不完全相同。由于细胞交流机制(即细胞-细胞接触、通过细胞骨架收缩在细胞外基质中传递张力或旁分泌)表现出特定的时间反应特征，因此有理由期待氧合的动态条件也能调节综合的集体伤口愈合细胞反应的时间特征。遗憾的是，我们目前对细胞集体反应所涉及的不同机制如何受动态氧合变化调节的了解几乎为零，因为大多数研究都集中在单细胞个体途径或恒定氧合条件下的集体过程。最后，应该考虑到的是，在体内，细胞对IH的反应不仅是这种挑战对细胞直接引起的反应，而且还通过循环可溶性因子或免疫细胞释放到血液中的间接影响作为对IH的全身反应。在这方面，以前有关内皮细胞的数据清楚地表明，用反复气道阻塞的大鼠或睡眠呼吸暂停患者的血清培养细胞，可调节伤口愈合。考虑到仍有许多问题有待解决，我们相信，目前实验中采用的实验方法应能帮助未来的研究阐明精确定义的IH范式如何调节单个和集体的综合细胞反应过程。

总之，这项研究强调了在模拟OSA的大量IH特征的背景下，与内皮细胞修复反应相关的深远差异，进一步强调了精确划分每时每刻细胞氧合特征的重要性。此外，我们在主动脉内皮细胞伤口愈合中的发现强烈表明，有必要调整实验IH范例，以可靠地再现影响体内每种特定细胞类型的缺氧水平。